安紅梅，柯潤(rùn)輝*，王麗娟，楊春艷，黃新望，田菲菲，尹建軍

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院, 北京，100015) 2(島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司, 北京，100020)

植物性肽粉是植物蛋白(如大豆蛋白、玉米蛋白等)的水解產(chǎn)物，經(jīng)后續(xù)處理、精煉后得到的低肽混合物，具有抗菌、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用等眾多的生理活性[1-3]，被廣泛應(yīng)用在功能飲料、保健品、功能食品及醫(yī)用食品領(lǐng)域，是當(dāng)今保健食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[4]。目前對(duì)肽的研究多集中在其生物功效與作用方面[2, 5]，而對(duì)其安全指標(biāo)的研究還較少。由于大豆、玉米等農(nóng)作物在種植過(guò)程中不可避免地會(huì)使用化學(xué)農(nóng)藥，由此所帶來(lái)的農(nóng)藥殘留問(wèn)題不容小覷。經(jīng)文獻(xiàn)查詢，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到有關(guān)植物性肽粉及制品中農(nóng)藥殘留研究的報(bào)道。為保障植物性肽粉的食用安全性，避免因農(nóng)藥殘留問(wèn)題給消費(fèi)者的健康和行業(yè)聲譽(yù)帶來(lái)?yè)p害，同時(shí)為完善肽生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量安全控制體系，有必要開(kāi)發(fā)適用于植物性肽粉及制品中簡(jiǎn)單、高效、通用性強(qiáng)的農(nóng)藥日常監(jiān)測(cè)方法。

有機(jī)磷農(nóng)藥是用于防治植物病蟲(chóng)害應(yīng)用量最大，應(yīng)用面最廣的農(nóng)藥品種之一，多數(shù)屬劇毒或高毒類，對(duì)人體有極大的危害[6]。研究表明，有機(jī)磷農(nóng)藥經(jīng)過(guò)皮膚、呼吸以及腸胃吸收等途徑進(jìn)入人體后，會(huì)危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而出現(xiàn)急性中毒癥狀或者慢性累積效應(yīng)[7]。目前，有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]等。質(zhì)譜法雖具有較高的靈敏度， 但其檢測(cè)投入大、 運(yùn)行成本高、 對(duì)使用人員的素質(zhì)要求亦較高[13]；ELISA法雖特異性較強(qiáng)，但酶制劑易失活容易導(dǎo)致反應(yīng)不穩(wěn)定、重復(fù)性差[14]；氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器(FPD)法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好，受基質(zhì)效應(yīng)影響較小、儀器成本較低且普及率高等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留分析中。本文應(yīng)用乙腈作為提取溶劑，經(jīng)石墨化炭黑氨基復(fù)合SPE柱凈化，氣相色譜-火焰光度法檢測(cè)，建立了同時(shí)測(cè)定植物肽粉中42種有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，能夠滿足植物肽粉及其制品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)和日常監(jiān)控的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸乙酯、甲苯、乙腈、正己烷和丙酮(均為色譜純)，美國(guó)J.T.Baker公司；NaCl(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱、石墨化炭黑-氨基復(fù)合固相萃取柱(500 mg/6 mL), 天津博納艾杰爾科技有限公司。

有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液：敵敵畏、速滅磷、乙酰甲胺磷、蟲(chóng)線磷、異吸硫磷、甲拌磷、氧樂(lè)果、特丁硫磷、百治磷、巴胺磷(胺丙磷)、八甲磷、乙拌磷、磷胺、樂(lè)果、甲基對(duì)硫磷、對(duì)氧磷、地毒磷、毒死蜱、馬拉硫磷、嘧啶磷、倍硫磷、水胺硫磷、滅蚜磷、喹硫磷、氯唑磷、稻豐散、抑草磷、殺蟲(chóng)畏、苯線磷、乙拌磷砜、滅菌磷、乙硫磷、硫丙磷、三硫磷、敵瘟磷、三唑磷、苯硫磷、苯線磷亞砜、 莎陴磷、溴苯磷、亞胺硫磷、吡菌磷(100 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)。

3個(gè)玉米肽粉，2個(gè)大豆肽粉，2個(gè)山藥肽粉，3豌豆肽粉，共10個(gè)樣品，購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幍?、超市?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀(GC-2010 PLUS，配有FPD檢測(cè)器)，日本島津公司；氮?dú)獯蹈蓛x(DC-12)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200 DB)，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA)，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取上述42種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.2 mL，用甲苯定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，0～4 ℃保存?zhèn)溆?。使用前移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用甲苯逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4 樣品制備

1.4.1 提取

稱取植物性肽粉試樣10.00 g于50 mL具塞離心管中，加入40 mL乙腈(對(duì)比實(shí)驗(yàn)為等量的丙酮、乙酸乙酯)和5 g NaCl，劇烈振蕩5 min，超聲30 min，6 000 r/min離心6 min，準(zhǔn)確取出20 mL上清液于50 mL雞心瓶中，于38 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL，待凈化。

1.4.2 凈化

石墨化炭黑-氨基復(fù)合柱凈化：用5 mL乙腈-甲苯(體積分?jǐn)?shù)為75%)潤(rùn)洗石墨化炭黑-氨基復(fù)合固相萃取小柱，保持柱體濕潤(rùn)，將上述提取濃縮液上柱，收集流出液，再用5 mL乙腈-甲苯(體積分?jǐn)?shù)為75%)洗滌雞心瓶，并上柱，再加入20 mL乙腈-甲苯(體積分?jǐn)?shù)為75%)洗脫液，保持流速1 mL/min，合并流出液，于38 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1mL甲苯溶解，上GC-FPD檢測(cè)。

Florisil固相萃取柱凈化：分別用丙酮-正己烷(體積分?jǐn)?shù)為10%) 和正己烷5 mL潤(rùn)洗Florisil固相萃取柱，保持柱體濕潤(rùn)。將上述提取濃縮液氮吹干，用2 mL正己烷復(fù)溶，上柱，收集流出液，再用5 mL丙酮-正己烷(體積分?jǐn)?shù)為10%)洗滌雞心瓶，并上柱，再加入5 mL丙酮-正己烷(體積分?jǐn)?shù)為10%)洗脫液，保持流速1 mL/min，合并流出液，于38 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1 mL甲苯溶解，上GC-FPD檢測(cè)。

1.5 氣相色譜條件

色譜柱為DB-17MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)安捷倫J&W公司)；載氣為高純度氮(純度99.999%)；恒流模式，柱流速為1.00 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；FPD檢測(cè)器溫度300 ℃，氫氣流量為62.5 mL/min；空氣流量為90.0 mL/min。

升溫程序：初始溫度100 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至210 ℃，以5 ℃/min的速率升至260 ℃，保持8 min，以8 ℃/min的速率升至280 ℃，保持3 min，總運(yùn)行時(shí)間為39 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的確定

在提取過(guò)程中，提取溶劑的選擇會(huì)直接影響待測(cè)物的回收率。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，同時(shí)結(jié)合有機(jī)磷農(nóng)藥的溶解性，實(shí)驗(yàn)比較了丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為肽粉中有機(jī)磷農(nóng)藥的提取劑，對(duì)3種提取劑的加標(biāo)回收率進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用乙腈提取時(shí)各農(nóng)藥的回收率為79.5%～101.3%，明顯高于乙酸乙酯(回收率為52.9%～78.1%)(圖1)。用丙酮的提取時(shí)各農(nóng)藥的回收率為75.6%～93.6%，與乙腈相差不大，但是其共提取的雜質(zhì)相對(duì)較多，故實(shí)驗(yàn)最后選擇為乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 固相萃取條件的選擇

Florisil柱、C18柱、石墨化炭黑/氨基復(fù)合柱(PestiCarb/NH2柱)是農(nóng)殘分析常用的固相萃取凈化柱，其中PestiCarb/NH2固相萃取柱上層是活性炭，脫色效果明顯，下層氨基能和糖類、蛋白質(zhì)、脂肪中的相關(guān)基團(tuán)形成氫鍵從而去除基質(zhì)中的大部分干擾物[18]；C18柱主要可去除基質(zhì)中脂肪等非極性雜質(zhì)[19], 但由于植物肽粉樣品中多為氨基酸組成的低肽段，脂肪含量較低，故無(wú)需用C18柱凈化。試驗(yàn)比較了Florisil柱和PestiCarb/NH2固相萃取柱凈化試樣對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明: Florisil柱和PestiCarb/NH2固相萃取柱在有機(jī)磷農(nóng)藥的凈化方面效果相當(dāng)，平均回收率分別為86.6%和90.2%，但由于Florisil柱在凈化過(guò)程中某些農(nóng)藥，如氯唑磷、甲基對(duì)硫磷、吡菌磷等農(nóng)藥的平均回收率偏低(分別為71.1%、80.8%和72.0%)，與使用PestiCarb/NH2柱相比有一定差距(平均回收率分別為88.7%、103.8%和85.6%)(圖2)，同時(shí)使用PestiCarb/NH2柱凈化后的溶液顏色比使用Florisil柱淺，除色素的能力較強(qiáng)。因此，最終選擇PestiCarb/NH2柱作為固相萃取凈化柱。

2.2 方法的基本性能

2.2.1 線性范圍及測(cè)定低限

使用玉米肽粉作為代表，取其空白樣品提取溶液作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液, 將2 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋至濃度為1.00、0.50、0.20、0.10、0.05 mg/L的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定, 以質(zhì)量濃度對(duì)相應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求得線性方程及相關(guān)系數(shù)。在0.05～1.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 相關(guān)系數(shù)R2大于0.99。以S/N=3計(jì)算方法中各種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出限(LOD)，其范圍為0.005～0.02 mg/kg；以S/N=10作為分析方法的定量低限，其范圍為0.015～0.060 mg/kg，見(jiàn)表1。圖3為濃度為0.10 mg/L的42種有機(jī)磷農(nóng)藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC-FPD譜圖。

表1 42種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 1 The retain time, linear range, correlation coefficient, and detection limit of 42 organophosphorus pesticides

續(xù)表1

名稱保留時(shí)間/min線性方程線性范圍/(mg·L-1)相關(guān)系數(shù)檢出限/(mg·kg-1)定量限/(mg·kg-1)磷胺216.079Y=3.6×105X+6 2580.05～1.000.993 60.0180.054甲基對(duì)硫磷16.571Y=2.9×106X+30 5440.05～1.000.999 30.0050.015對(duì)氧磷16.644Y=1.4×106X+25 5500.05～1.000.999 60.0100.030地毒磷16.847Y=2.5×106X+10 2780.05～1.000.999 40.0050.015毒死蜱16.986Y=2.7×106X+50 0020.05～1.000.999 10.0050.015馬拉硫磷17.126Y=2.3×106X+33 6120.05～1.000.999 30.0080.024嘧啶磷17.298Y=2.6×106X+10 2110.05～1.000.998 90.0050.015倍硫磷18.069Y=2.7×106X+30 2780.05～1.000.999 60.0050.015水胺硫磷18.65Y=2.5×106X+20 5890.05～1.000.999 50.0080.024滅蚜磷18.914Y=2.5×106X+35 7840.05～1.000.995 60.0080.024喹硫磷19.307Y=2.5×106X+68 4510.05～1.000.999 60.0080.024氯唑磷19.509Y=2.4×106X+20 3890.05～1.000.999 30.0080.024稻豐散19.591Y=1.5×106X+50 2230.05～1.000.999 10.0120.036抑草磷19.977Y=2.5×106X+20 3640.05～1.000.999 40.0080.024殺蟲(chóng)畏20.133Y=1.8×106X+56 9410.05～1.000.999 30.0100.030苯線磷20.503Y=1.5×106X+10 3690.05～1.000.999 20.0120.036乙拌磷砜21.08Y=1.4×106X+36 9980.05～1.000.996 30.0120.036滅菌磷21.223Y=2.5×106X+40 2810.05～1.000.999 10.0080.024乙硫磷22.232Y=2.8×106X+13 7990.05～1.000.999 50.0050.015硫丙磷23.067Y=2.2×106X+44 1150.05～1.000.997 20.0100.030三硫磷23.458Y=1.4×106X+28 9940.05～1.000.999 20.0150.045敵瘟磷24.502Y=5.0×105X+5 2440.05～1.000.999 60.0150.045三唑磷25.045Y=1.4×106X+45 8790.05～1.000.999 30.0150.045苯硫磷27.435Y=1.1×106X+23 6600.05～1.000.999 70.0150.045苯線磷亞砜28.128Y=3.0×105X+6 2310.05～1.000.999 00.0180.054莎陴磷29.028Y=6.0×105X+5 8770.05～1.000.997 20.0150.045溴苯磷29.635Y=7.0×105X+6 3000.05～1.000.998 50.0150.045亞胺硫磷30.348Y=6.0×105X+8 0990.05～1.000.999 10.0150.045吡菌磷31.017Y=7.0×105X+4 0560.05～1.000.998 90.0150.045

圖3 42種有機(jī)磷農(nóng)藥的GC-FPD譜圖(0.10 mg/L)Fig.3 GC-FPD chromatogram of 42 organophosphorus pesticides(0.10 mg/L)1-敵敵畏；2-速滅磷；3-乙酰甲胺磷；4-蟲(chóng)線磷；5-異吸硫磷；6-甲拌磷；7-氧樂(lè)果；8-特丁硫磷；9-百治磷；10-巴胺磷(胺丙磷)；11-八甲磷；12-乙拌磷；13-磷胺1；14-樂(lè)果；15-磷胺2；16-甲基對(duì)硫磷；17-對(duì)氧磷；18-地毒磷；19-毒死蜱；20-馬拉硫磷；21-嘧啶磷；22-倍硫磷；23-水胺硫磷；24-滅蚜磷；25-喹硫磷；26-氯唑磷；27-稻豐散；28-抑草磷；29-殺蟲(chóng)畏；30-苯線磷；31-乙拌磷砜；32-滅菌磷；33-乙硫磷；34-硫丙磷；35-三硫磷；36-敵瘟磷；37-三唑磷；38-苯硫磷；39-苯線磷亞砜；40-莎陴磷；41-溴苯磷；42-亞胺硫磷；43-吡菌磷

2.2.2 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

為考察方法的準(zhǔn)確性, 按照所確定的方法，選取某一空白玉米肽粉樣品在相應(yīng)線性范圍內(nèi)進(jìn)行2個(gè)水平的添加回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平做6 個(gè)平行樣品測(cè)定。結(jié)果表明，玉米肽粉中42種有機(jī)磷平均回收率均在72.8%～103.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍為2.44%～8.71%(表2)，該方法的回收率和RSD均符合檢測(cè)要求[20]。

2.3 實(shí)際樣品分析

為驗(yàn)證方法的可行性，采用實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)10種市售植物肽粉樣品(3玉米肽粉，2個(gè)大豆肽粉，2個(gè)山藥肽粉，3豌豆肽粉)進(jìn)行分析。若為陽(yáng)性樣品，需經(jīng)極性不同色譜柱進(jìn)行雙柱檢驗(yàn)或質(zhì)譜確證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10種植物性肽粉中42種有機(jī)磷農(nóng)藥均未檢出，在一定程度上說(shuō)明市面上植物性肽粉質(zhì)量具有可靠性。

表2 42種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率及其精密度(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSD of 42 organophosphorus pesticides (n=6)

續(xù)表2

名稱添加濃度0.05 mg/kg添加濃度0.5 mg/kg平均回收率/%RSD/%平均回收率/%RSD/%乙酰甲胺磷72.86.3178.98.71蟲(chóng)線磷88.24.6189.13.01異吸硫磷80.34.0290.22.98甲拌磷90.64.1893.12.73氧樂(lè)果80.65.0382.68.59特丁硫磷89.73.9988.13.05百治磷88.74.2290.63.66胺丙畏(巴胺磷)91.54.3691.62.87八甲磷90.83.8992.13.66乙拌磷84.64.3988.72.85磷胺177.46.0780.37.94樂(lè)果92.45.8490.66.05磷胺276.76.7177.68.13甲基對(duì)硫磷81.44.06103.83.16對(duì)氧磷94.63.6992.52.44地毒磷89.14.7890.62.69毒死蜱91.53.6998.73.14馬拉硫磷93.74.1293.52.85嘧啶磷88.13.6485.72.89倍硫磷82.64.8980.63.61水胺硫磷90.85.0194.44.01滅蚜磷84.65.3390.33.75喹硫磷91.74.2394.82.99氯唑磷88.75.6492.63.33稻豐散93.13.1890.82.45抑草磷84.54.5585.13.82殺蟲(chóng)畏85.63.8984.93.01苯線磷90.54.2188.73.46乙拌磷砜76.73.6998.32.89滅菌磷88.33.4795.63.01乙硫磷80.53.8490.72.55硫丙磷92.64.0392.32.59三硫磷86.15.0189.43.75敵瘟磷84.33.6688.62.86三唑磷85.74.0591.33.06苯硫磷82.13.6685.62.57苯線磷亞砜82.33.7887.43.16莎陴磷90.64.0890.63.06溴苯磷85.84.6688.14.02亞胺硫磷79.43.7982.63.19吡菌磷78.35.0485.63.38

3 結(jié)論

本文建立了植物性肽粉中同時(shí)測(cè)定42種有機(jī)磷農(nóng)藥的GC-FPD分析方法，通過(guò)乙腈提取，PestiCarb/NH2固相萃取柱凈化，在選定的色譜條件下可以實(shí)現(xiàn)植物肽粉中42種有機(jī)磷農(nóng)藥的分離與定量。該方法在0.05～1.00 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 相關(guān)系數(shù)R2大于0.99，最低檢出限為0.005～0.020 mg/kg；在0.05～0.5 mg/kg 的添加水平，42種有機(jī)磷的平均回收率在72.8%～103.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.44%～8.71%，該方法具有良好的回收率和精密度，可用于植物性肽粉及其制品中有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)，且能夠滿足我國(guó)食品中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2014的檢測(cè)需求。