宋明承，劉　妍，赫慧文，陳慧琳，張　晨，陳　翀，羅云萍

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院 免疫學系， 北京 10005)

肺癌是當今世界嚴重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，也是世界范圍內(nèi)最常見的人類惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢。其中非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%～85%[1]。肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶Ⅰ(carnitine palmityl transferase 1,CPT1)是脂肪酸氧化的限速酶，位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)。乙莫克舍(etomoxir)是不可逆的CPT1的抑制劑[2]。它與CPT1的催化部位不可逆結(jié)合。抑制CPT1活性可上調(diào)脂肪酸氧化酶活性。有研究表明etomoxir可以增強細胞的凋亡從而對腫瘤起到抑制作用[3]。最近有研究報道，etomoxir可以明顯抑制MYC高表達的三陰性乳腺癌的生長，然而它對非小細胞肺癌的作用還不清楚[4]。順鉑是一種無機鉑絡(luò)合物，在腫瘤細胞中能夠通過形成DNA加合物抑制 DNA合成，順鉑通過與DNA相互作用形成DNA交聯(lián)劑誘導(dǎo)細胞毒性，激活多條信號傳導(dǎo)通路, 包括Erk、p53、p73和MAPK,其中對激活凋亡影響最大[5]。目前，順鉑是最廣泛使用的肺癌化療藥物之一。然而，順鉑毒不良反應(yīng)較大，并且腫瘤細胞容易產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)[6]。通過前期實驗發(fā)現(xiàn)，敲低CPT1可以促進腫瘤細胞對順鉑的敏感性。本研究的目的是利用CPT1的小分子抑制劑etomoxir，通過影響CPT1活性，進而影響并協(xié)同常規(guī)化療藥物順鉑，提高腫瘤細胞對該化療藥的敏感性，抑制腫瘤細胞增殖并促進凋亡，從而為提高非小細胞肺癌化療效果提供新的方案。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細胞系及培養(yǎng)基：A549(人類非小細胞肺癌細胞系，1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng))(ATCC);RPMI 1640、PBS(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心)。

1.1.2其他試劑和材料：0.25%胰蛋白酶Trypsin、鏈霉素-青霉素溶液和胎牛血清 (Gibco公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(Bimake公司)；DMSO(Sigma-Aldrich公司)；順鉑和etomoxir(Selleck公司)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ(BD公司)

1.1.3實驗動物：SPF級周齡為8周的雄性裸鼠20只[中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所實驗動物中心SCXK(京)2014-0004]，所有實驗用小鼠質(zhì)量均為20 g。

1.2　方法

1.2.1細胞增殖測定：在 96孔板中配置 200 μL 的細胞懸液，使細胞數(shù)為5 000個/孔。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 12 h(37 ℃、5% CO2條件下)；向培養(yǎng)板中加入 10 μL 不同濃度的待測藥物。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中避光孵育相應(yīng)的時間(24、48及72 h)；向每孔中加入 10 μL CCK溶液(避免氣泡產(chǎn)生)；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 0.5～4 h。用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度值，檢測細胞活力。

1.2.2細胞培養(yǎng)及分組處理：A549細胞分為4組：A組為A549細胞中加DMSO培養(yǎng)(對照組)；B組為A549細胞中加etomoxir(75 μmol/L)；C組為A549細胞加順鉑(7.5 μmol/L)；D組為A549細胞加etomoxir和順鉑。培養(yǎng)24 h后如上更換1次培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后再次如上更換1次培養(yǎng)基。

1.2.3Transwell細胞遷移實驗：下室加入500 μL 1640培養(yǎng)基(含10% FBS)，上室加入藥物處理72 h后的A549細胞，2.5×105個/孔；培養(yǎng)7 h后終止培養(yǎng),PBS吹洗2次，棉簽擦去上室內(nèi)側(cè)A549腫瘤細胞，留取外側(cè)面遷移下來的A549細胞，將小室浸于4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，棉簽再次擦去上室內(nèi)側(cè)壁雜色，清水反復(fù)清洗5次，鏡下觀察遷移至外側(cè)面的A549細胞并拍照，隨機選取5個視野計數(shù)。

1.2.4流式細胞計量術(shù)：吸取PBS將已經(jīng)過藥物處理72 h的各組A549細胞倒掉液體，用PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化5 min,2 000 r/min離心5 min，收集各組A549細胞，按試劑盒說明加入試劑盒內(nèi)試劑，以重懸細胞，將其吸入離心管中備用；采用annexin V-FITC/PI雙染法，將5 μL annexin V和5 μL PI混勻后加入樣品中，避光常溫孵育15 min；再按試劑盒說明加入盒內(nèi)試劑，把細胞吹打混懸，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率；實驗重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)分析用Flowjo軟件分析。

1.2.5動物實驗：將小鼠隨機分為4組，每組6只。第一天給所有小鼠(部位)接種100 μL(5×106個/mL)A549細胞。從第14天開始給藥治療(腹腔注射)，每周給藥2次，同時測量小鼠體質(zhì)量及瘤體大小。給藥方案如下：A組每只小鼠注射200 μL PBS；B組每只小鼠注射200 μL順鉑(5 mg/kg)溶液；C組每只小鼠注射200 μL etomoxir(20 mg/kg)溶液；D組每只小鼠注射200 μL 順鉑(5 mg/kg)與etomoxir(20 mg/kg)混合藥物溶液。經(jīng)3周治療后，斷頸處死小鼠并取腫瘤與肺組織，稱重并拍照，其后用4%多聚甲醛固定保存組織。

1.3　統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1　Etomoxir與順鉑的藥物工作濃度測定

隨著藥物濃度的增加，A549細胞活力逐漸降低(P<0.05)(圖1A)，選取順鉑7.5 μmol/L作為后續(xù)實驗藥物使用濃度；用不同濃度的etomoxir處理細胞72 h，隨著藥物濃度的增加，A549細胞活力逐漸降低(P<0.05)(圖1B)，選取etomoxir 75 μmol/L作為后續(xù)實驗藥物使用濃度。

2.2　經(jīng)etomoxir與順鉑藥物聯(lián)用腫瘤細胞增殖受到明顯抑制

與對照組相比，順鉑處理細胞后細胞活力下降(P<0.05)；與etomoxir處理組相比，順鉑聯(lián)合etomoxir處理細胞后細胞活力明顯下降，(P<0.001)；與順鉑處理組相比順鉑聯(lián)合etomoxir處理細胞后細胞活力明顯下降(P<0.001)(圖2)。

A.toxicity of cisplatin to A549 cells,*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L cisplatin)；B.toxicity of etomoxir to A549 cells;*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L etomoxir)

圖1不同濃度順鉑或etomoxir處理肺癌A549細胞72h對其增殖影響

*P<0.05,**P<0.001 compared with etomoxir, △P<0.001 compared with cisplatin圖2　不同藥物處理肺癌細胞A549 72 h對其增殖影響Fig 2　Effects of different drug on cell growth of A549

2.3　經(jīng)etomoxir與順鉑藥物聯(lián)用腫瘤細胞的遷移能力明顯受到抑制

經(jīng)藥物處理72 h后，對處理細胞進行Transwell實驗。與對照組和單用etomoxir及單用順鉑組相比，順鉑聯(lián)用etomoxir可降低腫瘤細胞的遷移能力(圖3)。

2.4　Etomoxir與順鉑藥物聯(lián)用促進腫瘤細胞凋亡

經(jīng)藥物處理72 h后，順鉑組較對照組增殖抑制率有升高(P<0.05); 順鉑聯(lián)合etomoxir組增殖抑制率較順鉑組明顯升高(P<0.001); 較etomoxir組有明顯升高(P<0.0001)(圖4)。與對照組相比，順鉑組細胞凋亡率增加(P<0.05)；順鉑聯(lián)合etomoxir組較順鉑組促進A549細胞凋亡的作用更加明顯(圖4)。

A.control group; B.etomoxir group; C.cisplatin group; D.cisplatin+etomoxir group; E.number of migration cells；*P<0.0001 compared with etomoxir；△P<0.0001 compared with cisplatin

A.control group; B.etomoxir group; C.cisplatin group; D.cisplatin+etomoxir group; E.apoptotic index(AI%)；#P<0.05 compared with control；*P<0.001 compared with etomoxir；△P<0.0001 compared with cisplatin

2.5　順鉑聯(lián)合etomoxir在小鼠荷瘤實驗中對肺癌腫瘤的治療效果

順鉑聯(lián)合etomoxir治療組的腫瘤體積均明顯小于對照組、單用etomoxir治療組和單用順鉑治療組，實驗結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。在小鼠荷瘤實驗中可以看出經(jīng)過順鉑聯(lián)用etomoxir藥物治療后，小鼠的腫瘤生長受到明顯的抑制。

3　討論

目前認為腫瘤發(fā)生發(fā)展是多因素多階段發(fā)展的動態(tài)過程，由腫瘤本身及腫瘤與腫瘤微環(huán)境之間多種相互作用共同影響[7]。脂肪酸參與了腫瘤細胞的多個生物學過程：首先，脂肪酸參與細胞膜重要構(gòu)成分子的合成，故腫瘤細胞的快速增殖有賴于大量的脂肪酸[8]；其次，在許多類型的腫瘤中，脂肪酸的β-氧化是腫瘤細胞的重要功能方式[9]。另外，多種研究表明，在多種腫瘤中，脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵基因通過調(diào)控其相關(guān)代謝酶的表達進而影響腫瘤的生長[10-12]。CPT1作為細胞內(nèi)脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶參與脂肪酸代謝過程，具有重要生物學意義[3]。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)：將腫瘤細胞的CPT1基因敲低后，腫瘤增殖受到抑制，同時促進腫瘤細胞的凋亡。Etomoxir作為CPT1的不可逆抑制劑，抑制CPT1活性。順鉑雖然作為肺癌化療的重要化療藥，但由于其存在一定的毒副作用，特別是其耐藥的發(fā)生嚴重影響順鉑的臨床療效。本實驗證實了相較于單獨使用藥物順鉑或etomoxir，順鉑在聯(lián)合了CPT1抑制劑etomoxir后，使非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549的增殖受到更為明顯的抑制，同時還促進了該腫瘤細胞系的凋亡。不僅如此，對腫瘤細胞系A(chǔ)549細胞的遷移作用也有明顯的抑制。小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，順鉑與etomoxir的聯(lián)合用藥可以明顯抑制腫瘤的生長。這說明可以通過CPT1的小分子抑制劑etomoxir與順鉑聯(lián)合用藥增強化療藥順鉑對腫瘤細胞的抑制作用。其機制可能是etomoxir通過對CPT1的抑制作用使腫瘤微環(huán)境中脂肪酸的氧化能力降低，造成脂肪酸利用下降，使腫瘤細胞能量供應(yīng)不足，造成DNA合成能量不足；同時順鉑在腫瘤細胞中通過形成DNA加合物抑制DNA的合成。故etomoxir可以協(xié)同順鉑作用，使順鉑對腫瘤細胞的抑制作用增強，為臨床非小細胞肺癌化療方案提供新的思路。

A.image of mouse tumors at the 31st day after bearing tumor cells； B.tumor volume comparison of mouse lung cancer between different treatment groups;*P<0.05 compared with cisplatin group；#P<0.05 compared with etomoxir group