李北芳，高　霞，張朦琦，葛　賽，李忠武，沈　琳，高　靜*

(1.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院 北京市腫瘤防治研究所 消化腫瘤內(nèi)科 惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142； 2.萊陽中心醫(yī)院 腫瘤科，山東 萊陽 265200； 3.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院 北京市腫瘤防治研究所病理科 惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室， 北京 100142)

2014年癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)首次將胃癌從分子水平分為4個亞型，其中EBV相關(guān)性胃癌(Epstein-Barr virus associated gastric cancer，EBVaGC)因程序性死亡蛋白配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)高表達(dá)/擴(kuò)增可能是免疫治療的適宜群體而廣受關(guān)注[1]。EBVaGC在整體胃癌中約占8%～10%，因腫瘤分期、地域和種族因素而有所不同，其臨床表現(xiàn)和分子特征也與EBV非相關(guān)性胃癌(Epstein-Barr virus non-associated gastric cancer，EBVnGC)(也稱EBV陰性胃癌)存在很大差異[2]，目前尚缺乏特異性治療方案。深入挖掘疾病分子特征對指導(dǎo)治療非常重要，因此本研究旨在運用組學(xué)手段分析中國EBVaGC的分子特征。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1患者和組織樣本：2012年6月至2015年12月于北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科保存的78例Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者手術(shù)標(biāo)本及消化內(nèi)科接受治療的61例Ⅳ期胃癌患者胃鏡移植瘤(patient-derived xenograft，PDX)組織納入該研究，PDX建立流程參見報道[3]。本研究通過了北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)且患者均簽署科研樣本使用知情同意書。

1.1.2主要試劑：EBER(EBV encoded RNA)原位雜交試劑盒、DAB 顯色試劑盒、EDTA抗原修復(fù)液、羊血清抗原封閉液和羊抗鼠IgG-HRP (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；VENTANA PD-L1(SP142)分析試劑盒(Roche公司)。

1.2　方法

1.2.1EBER原位雜交：大致流程為:1)4 μm厚石蠟包埋組織切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟、水化；2)蛋白酶消化；3)地高辛標(biāo)記EBER探針雜交；4)HRP標(biāo)記抗地高辛抗體孵育；5)DAB顯色。EBV陽性定義為20%及以上的腫瘤細(xì)胞EBER核表達(dá)陽性。所有組織切片染色結(jié)果由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科專職病理人員獨立判讀。

1.2.2DNA靶向捕獲測序：采用Illumina Hiseq 4000測序平臺對483個腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行全外顯子測序，流程：1)提取胃癌組織DNA，修飾DNA片段構(gòu)建文庫，對文庫有效濃度(2 nmol/L)進(jìn)行準(zhǔn)確定量并質(zhì)檢；2)質(zhì)檢合格后，進(jìn)行PE150測序；3)對原始測序數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行精細(xì)過濾，得到過濾后數(shù)據(jù)(clean reads)用于后續(xù)分析；4)將高質(zhì)量的序列比對到人參考基因組上，分析解讀樣本中的變異信息。

1.2.3蛋白質(zhì)譜技術(shù)：采用Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀(Thermo-Fisher公司)進(jìn)行檢測分析。1)組織蛋白提取、酶解及液相分離；2)上機(jī)檢測后將原始文件與人源NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行圖譜匹配及蛋白鑒定；3)293T細(xì)胞的總蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，其操作流程和檢測參數(shù)與待測樣本相同以進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控；4)運用DAVID和KEGG數(shù)據(jù)庫對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)和富集分析。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色：1)4 μm厚組織切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟、水化；2)EDTA抗原修復(fù)及3% H2O2處理；3)羊血清封閉后一抗4 ℃孵育過夜；4)抗IgG-HRP室溫孵育1 h后進(jìn)行DAB顯色。10%或以上腫瘤細(xì)胞染色判定為PD-L1表達(dá)陽性，否則判定為陰性。染色切片由病理科專職病理人員獨立判讀。

1.3　統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較及相關(guān)性分析使用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。

2　結(jié)果

2.1　EBVaGC與EBVnGC腫瘤組織的基因變異比較

在78例Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者手術(shù)標(biāo)本中，6例判斷為EBVaGC(7.70%)，72例為EBVnGC。與EBVnGC(4.17%，3/72)相比，EBVaGC中PIK3CA突變率顯著升高(83.33%，5/6；P<0.05)，PIK3CA突變位點包括K111del、E542K、E545K、Q546R、I1058M和A1066V突變，其中K111del和I1058M尚未見osmic數(shù)據(jù)庫報道。對于在眾多腫瘤中突變率非常高的TP53基因，在EBVaGC中的突變率(16.67%，1/6)顯著低于EBVnGC患者(52.78%，38/72；P<0.05)。此外，EBVaGC中ARID1A(3/6vs8/72)和APC(3/6vs6/72)基因突變患者各3例，突變率均高于相應(yīng)的EBVnGC患者(圖1)，其他基因尚未見顯著差別。

圖1　EBVaGC組織DNA靶向捕獲測序基因變異情況Fig 1　Genes variation of targeted capture sequencing in EBVaGC

2.2　EBVaGC和EBVnGC腫瘤組織的蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果

發(fā)現(xiàn)48個蛋白僅在6例EBVaGC中上調(diào)表達(dá)，主要與胞外外泌體、黏著斑、翻譯后修飾、乙?；偷鞍琢姿峄确肿酉嚓P(guān)(圖2A)；同樣，發(fā)現(xiàn)50個蛋白僅在6例EBVaGC中下調(diào)表達(dá)，主要與胞外外泌體、代謝通路、氧化磷酸化、NAD(P)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、ATP合成酶復(fù)合物和神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病等分子相關(guān)(圖2B)。

2.3　EBV陽性與陰性PDXs組織基因變異情況

在61例胃癌PDXs組織中，13例判斷為EBV陽性(21.31%)，48例判斷為EBV陰性。靶向捕獲測序結(jié)果提示，13例EBV陽性PDXs中未檢測出PIK3CA突變，48例EBV陰性組織中PIK3CA突變者7例，不同于上述胃癌患者腫瘤組織測序結(jié)果。而類似的是，EBV陽性PDXs組織中TP53的突變率(0%，0/13)顯著低于EBV陰性PDXs組織(35.42%，17/48；P<0.05)。未發(fā)現(xiàn)EBV陽性和陰性PDXs組織中差異顯著的其他基因變異。

2.4　EBV陽性PDXs組織PD-L1表達(dá)較高

PD-L1在進(jìn)展期胃癌PDXs組織中的陽性率為36.07%(22/61)，且在13例EBV陽性PDXs組織中陽性率為76.92%(10/13)，顯著高于其在EBV陰性PDXs組織中的陽性率(25.00%，12/48；P<0.05)(圖3)。

3　討論

2014年TCGA基于分子分型首次提出EBVaGC，

圖2　EBVaGC中特有上調(diào)蛋白(A)和下調(diào)蛋白(B)通路富集結(jié)果Fig 2　Pathway enrichment of special up-regulated (A) and down-regulated (B) proteins in EBVaGC

圖3　胃癌PDXs組織EBER原位雜交染色(A)和PD-L1免疫組織化學(xué)染色(B)Fig 3　EBER chromogenic in situ hybridization(A) and immunohistochemical staining of PD-L1(B) in PDXs

目前相關(guān)研究非亞洲人群居多，本研究即在中國胃癌患者中運用組學(xué)手段在基因和蛋白表達(dá)水平挖掘EBVaGC與EBVnGC的分子差異，以為后續(xù)深入探索提供依據(jù)。

本研究顯示EBVaGC中存在PIK3CA高頻突變，而在EBV陽性PDXs中卻未檢測到突變，有報道PIK3CA突變可與EBV產(chǎn)物相互作用進(jìn)而激活PI3K/ATK通路[4]，這提示PIK3CA或通路狀態(tài)可能參與EBVaGC的發(fā)生發(fā)展。此外，EBVaGC中存在ARID1A高頻突變，一項在子宮內(nèi)膜癌中的研究表明ARID1A表達(dá)缺失多伴隨PI3K/AKT通路激活，且更傾向于TP53基因野生表達(dá)[5]。然而，PIK3CA與ARID1A突變的關(guān)系及其在EBVaGC中的作用和機(jī)制還有待深入研究。

TP53突變是眾多腫瘤中最為普遍的分子事件，尤其在染色體不穩(wěn)定型胃癌中TP53頻發(fā)突變，然而EBVaGC卻罕見突變，這一現(xiàn)象的可能機(jī)制是野生型TP53編碼的野生型P53蛋白對EBV早期復(fù)制至關(guān)重要[6]，而在復(fù)制后期又可將其降解而干擾抑癌功能[7]。P53基因和蛋白在EBVaGC發(fā)生發(fā)展中的具體作用還有待深入探索。

EBV在進(jìn)展期胃癌PDXs中的陽性率為21.31%，而在進(jìn)展期胃癌活檢組織標(biāo)本中比例很低(1.01%，1/99，結(jié)果未顯示)，顯著低于早期胃癌患者，這與一項在IV期胃癌中的研究結(jié)果[8]一致，可能由于患者本身存在EBV潛伏感染，當(dāng)腫瘤組織轉(zhuǎn)入免疫缺陷的小鼠體內(nèi)時，免疫防御減低促進(jìn)了EBV激活復(fù)制。

以PD-1/PD-L1為主的免疫治療是當(dāng)下熱點[9- 10]，本研究發(fā)現(xiàn)在進(jìn)展期EBV陽性PDXs中PD-L1表達(dá)顯著升高，這也為EBVaGC患者進(jìn)行PD- 1/PD-L1治療提供參考。目前，部分臨床研究(NCT03257163，NCT02589496)已納入EBVaGC患者，效果值得期待。

總之，本研究結(jié)合靶向捕獲測序及蛋白質(zhì)譜技術(shù)在胃癌患者及PDXs組織中對EBVaGC的分子特征進(jìn)行了分析，更多分子特征及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療中的作用還有待深入探索。