王　堅，孫玉慧

(蘇州大學 神經科學研究所， 江蘇 蘇州 215123)

皮質脊髓束(corticospinal tract，CST)是脊髓中重要的調控運動功能的神經傳導束[1]。CST神經軸突起源于體感運動皮質第五、六層的錐體神經元，其軸突終末廣泛存在于不同脊髓節(jié)段的神經元群體中，支配到脊髓灰質的中間神經元及α運動神經元等[2-4]。生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine，BDA)是一種雙向神經示蹤劑，其生物學性狀穩(wěn)定，轉運距離遠，可長時保存，是研究CST軸突結構和連續(xù)性最常用的工具[5]。腺相關病毒(adeno associated virus，AAV)為單鏈DNA病毒，感染效率高，安全性好，感染神經元后可快速、長期、穩(wěn)定地表達目的蛋白，廣泛應用于神經環(huán)路的研究[6-7]。AAV病毒載體若經過改造，同時實現(xiàn)對被感染神經元的基因操作和形態(tài)學示蹤，對于研究損傷后的軸突再生將是一種非常便捷的工具。AAV與BDA對于小鼠CST軸突的示蹤效果是否存在差別，目前尚不清楚。本研究通過比較二者對小鼠CST的標記效果，探討AAV作為順行神經示蹤劑用于脊髓損傷后的CST軸突再生及相關環(huán)路研究的優(yōu)勢。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物：SPF級雌性C57BL/6成年小鼠共30只，質量20～22 g[上海斯萊克實驗動物公司生產許可證號：SCXK(滬)2013-0018]。飼養(yǎng)于蘇州大學實驗動物中心，所有實驗操作均嚴格按照蘇州大學動物管理委員會要求執(zhí)行。

1.1.2實驗試劑：BDA(10 000 MW，10%)、驢抗羊Alexa Fluor 488-IgG(H+L)抗體(Invitrogen公司)；AAV8-CAG-GFP-2A(和元生物技術股份有限公司，滴度1 013 GC/mL)；TSA plus cyonine3 system試劑盒(Perkin Elmer公司)；羊抗鼠GFP抗體(Abcam公司)。

1.2　方法

1.2.1實驗動物分組及處理：將小鼠分為正常組和脊髓損傷組。脊髓損傷方法：4%水合氯醛(0.2 mL/20 g)麻醉小鼠，切除T8節(jié)段椎板充分暴露脊髓，顯微手術刀完全切斷T8脊髓。依次縫合肌肉、筋膜、表皮，并消毒。術后1周每天肌肉注射1×104U 青霉素鈉。每天排尿兩次。正常組和脊髓損傷組(損傷后4周)分別立體定位注射AAV和BDA。立體定位注射方法：以小鼠大腦Bregma點為原點，在距離中線1.5 mm的左側大腦皮質(-1.5)， AP方向坐標(單位mm)：0/-1.5，-0.5/-1.5，-1.0/-1.5打3個孔，微量注射器以深度0.5 mm向各個孔注射0.6 μL AAV或BDA。

1.2.2組織冰凍切片：注射AAV或BDA兩周后，水合氯醛麻醉小鼠，4%多聚甲醛灌注并后固定，經20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，OCT包埋。頸段及胸段脊髓組織分別進行冠狀面和矢狀面冰凍切片，切片厚度為30 μm。

1.2.3免疫組織化學染色：AAV注射組小鼠組織切片經1% Triton X-100通透30 min，2% BSA封閉1 h，羊抗鼠GFP抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜后，驢抗羊Alexa Fluor 488-IgG(H+L)二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，Mounting Medium封片。BDA注射組，組織切片經4% PFA后固定，0.3% H2O2和50%乙醇的混合溶液孵育10 min，0.1 mol/L甘氨酸孵育10 min，含0.5% blocking reagent的封閉液孵育30 min。Strepavidin-HRP (1∶500) 4 ℃孵育過夜，含Tyramide (1∶250) 的放大液室溫孵育5 min，Mounting Medium封片。激光共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，LSM 700)采集免疫組化圖像。使用ImageJ軟件統(tǒng)計CST軸突束(bundle)區(qū)域及周圍軸突分支(branch)的熒光強度，減去背景熒光強度后，以CST軸突束區(qū)域的熒光強度作為參照(100%)，計算軸突束及軸突分支的相對熒光強度(%)。

1.3　統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1　AAV及BDA對于正常小鼠脊髓頸段的CST示蹤效果的比較

在小鼠脊髓頸段，AAV和BDA均能夠清晰地標記到向尾端投射的緊密的CST軸突束(圖1A，B；圖2A，B)以及軸突分支(圖1a1，b1，a2，b2；圖2a1，b1)。AAV和BDA對于CST軸突束的示蹤效果沒有顯著差異，而AAV標記的軸突分支的相對熒光強度顯著高于BDA標記的軸突分支(圖1C；圖2C)。

A:CST axons traced by AAV, a1-a2.high magnification of boxed areas in A; B:CST axons traced by BDA, b1-b2.high magnification of boxed areas in B; C:quantification of relative fluorescence intensity of CST axons;*P<0.05 compared with AAV

圖1AAV及BDA標記正常小鼠頸段冠狀面CST軸突的比較

A:CST axons traced by AAV, a1.high magnification of boxed area in A; B:CST axons traced by BDA, b1.high magnification of boxed area in B; C:quantification of relative fluorescence intensity of CST axons;*P<0.05 compared with AAV

圖2AAV及BDA標記正常小鼠頸段矢狀面CST軸突的比較

2.2　AAV及BDA對于正常小鼠脊髓胸段的CST示蹤效果的比較

同樣地，在脊髓胸段AAV和BDA均能夠清晰地標記到緊密的CST軸突束向尾端投射(圖3A，B；圖4A，B)以及相應的軸突分支(圖3a1，a2，b1，b2；圖4a1，b1)。AAV和BDA對CST軸突束的示蹤效果相似，而AAV標記到的軸突分支的相對熒光強度顯著高于BDA標記的軸突分支(圖3C;圖4C)，這一現(xiàn)象在冠狀面切片中更為明顯(圖3C)。

2.3　AAV及BDA對于脊髓損傷小鼠脊髓胸段的CST示蹤效果的比較

在脊髓損傷小鼠中， AAV及BDA同樣都能夠標記到脊髓胸段的CST軸突束和分支(圖5A，B)，AAV及BDA標記的CST軸突均停止于損傷區(qū)域邊緣頭端，損傷的神經軸突前段均可見清晰的回縮小泡(圖5a2，b2)。與BDA相比，AAV不但能夠標記到經典的緊密的CST軸突束(圖5A)，而且標記到了更廣泛的軸突分支(圖5C)。

A:CST axons traced by AAV, a1-a2.high magnification of boxed areas in A; B:CST axons traced by BDA, b1-b2.high magnification of boxed areas in B; C:quantification of relative fluorescence intensity of CST axons;*P<0.001 compared with AAV

A:CST axons traced by AAV, a1.high magnification of boxed area in A; B:CST axons traced by BDA, b1.high magnification of boxed area in B; C:quantification of relative fluorescence intensity of CST axons;*P<0.05 compared with AAV

A:CST axons traced by AAV, a1-a2.high magnification of boxed areas in A; B:CST axons traced by BDA, b1-b2.high magnification of boxed areas in B; C:quantification of relative fluorescence intensity of CST axons;*P<0.05 compared with AAV

圖5AAV及BDA標記脊髓損傷小鼠胸段矢狀面CST軸突的比較

3　討論

多年來，BDA廣泛應用于CST軸突的順行示蹤和脊髓損傷后CST軸突再生的研究。BDA可被神經元及其突起攝取，主要以擴散的方式在軸漿中運輸抗生物素蛋白(親和素avidin或鏈霉親和素streptavidin)，與BDA中的生物素反應可進行顯色[8-9]。BDA與多種熒光示蹤劑和各種免疫組織化學技術相結合，可滿足光學顯微鏡及電鏡下觀察的要求。同時，BDA注射到動物體內后仍面臨被自體代謝掉的問題，在體內存留時間不能過長。

綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)及其突變體的發(fā)現(xiàn)促使腺相關病毒在神經環(huán)路的研究中發(fā)揮重要的作用[10]。本研究采用的AAV8-CAG-GFP-2A病毒可高效感染小鼠體感運動皮質的錐體神經元，并長期穩(wěn)定表達GFP蛋白，相較于BDA可在生物體內存留更長時間，能滿足對實驗動物長期監(jiān)測的需求。通過分子生物學方法改造AAV病毒載體，可在神經示蹤的同時，在特定類型神經元中特異性導入或干擾目的基因表達[11]；結合Cre-LoxP系統(tǒng)可實現(xiàn)在特定神經元中的基因敲除[12]；向神經元中引入ChR2 (channelrhodopsin2)、 NpHR(halorhodopsin)等光敏感蛋白，可通過光遺傳學調控神經元活動[13-14]；采用新型跨突觸AAV病毒可追蹤CST下游的神經元或神經核團[15]。BDA作為單純的神經示蹤劑不具備這些優(yōu)勢。

本研究比較AAV和BDA的示蹤效果，發(fā)現(xiàn)二者在正常小鼠及脊髓損傷小鼠脊髓中對CST軸突束的示蹤效果一致，而AAV相較于BDA能夠標記到更多向灰質中投射的CST軸突分支。AAV表達的GFP蛋白在神經軸突中的轉運能力強于BDA在軸突中的擴散能力，可能是導致AAV標記的CST軸突分支更加清晰和廣泛的原因。未來進一步對AAV8-CAG-GFP-2A病毒載體進行改造，可實現(xiàn)基因表達/功能調控和神經示蹤的雙重功能。因此，AAV作為替代BDA的一種新型神經示蹤劑，對小鼠CST的形態(tài)學及局部神經環(huán)路的研究具有更大的優(yōu)勢。