張　爽，馮沖凌，歐陽林男，李劉剛，吳曉芙

（中南林業(yè)科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

土壤、植物和微生物之間的相互作用被認(rèn)為是生態(tài)系統(tǒng)功能的主要驅(qū)動(dòng)力[1]，其中微生物能對(duì)任何植被或土壤性質(zhì)的改變做出快速響應(yīng)[2-3]。礦區(qū)生態(tài)修復(fù)進(jìn)程中細(xì)菌群落的多樣性和豐富性對(duì)于保持礦區(qū)植被土壤質(zhì)量，維持生產(chǎn)力和生態(tài)平衡至關(guān)重要。有機(jī)菌肥作為一種無二次污染、高效率的改良劑，兼具改善土壤養(yǎng)分條件和降低重金屬等污染物生物有效性的雙重功能[4]，它的應(yīng)用在一定程度上能加快礦區(qū)植被的恢復(fù)進(jìn)程，但這又會(huì)反過來對(duì)土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生影響[5]。有研究表明，基于土壤重金屬濃度的不同與土壤相關(guān)的功能菌群如固氮細(xì)菌、氨氧化細(xì)菌、甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和反硝化細(xì)菌等也會(huì)出現(xiàn)顯著變化[6-9]。了解不同植物群落修復(fù)模式對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的影響對(duì)開發(fā)更好的礦山生態(tài)修復(fù)技術(shù)具有重要意義[10]。

課題組前期以湘潭錳礦尾礦區(qū)礦渣為基質(zhì)、專用有機(jī)菌肥為改良劑，開展了植物-有機(jī)菌肥聯(lián)合修復(fù)中試試驗(yàn)。結(jié)果顯示有機(jī)菌肥能明顯提高植物的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)能力，增大植物生物量、株高和重金屬積累量，其中復(fù)合植物-有機(jī)菌肥處理的生態(tài)修復(fù)效果最好，形成的草-灌-喬空間結(jié)構(gòu)具有保水性強(qiáng)，植物多樣性豐富和重金屬擴(kuò)散率低等綜合特點(diǎn)[11]。本研究以中試試驗(yàn)裝置內(nèi)的植物根際土壤為研究對(duì)象，結(jié)合高通量測(cè)序分析細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)與多樣性，為進(jìn)一步探究在有機(jī)菌肥改良下植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的機(jī)理提供依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1　中試系統(tǒng)試驗(yàn)處理

以專用有機(jī)菌肥作為改良劑，根據(jù)課題組前期盆栽試驗(yàn)結(jié)果，選擇欒樹、泡桐、夾竹桃、小葉女貞以及本土先鋒植物商陸等重金屬積累量大、生長(zhǎng)速度快的植物開展中試系統(tǒng)試驗(yàn)[11]，試驗(yàn)處理見表1。試驗(yàn)裝置儲(chǔ)量360 kg，設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，供試植物由湖南省林業(yè)科學(xué)院提供且均為同批1年生實(shí)生苗，其中商陸為礦渣自然萌生植物。試驗(yàn)用礦渣基本理化性質(zhì)見表2；基于課題組前期研究[12]，試驗(yàn)用有機(jī)菌肥的配置情況見表3。

表 1　不同植物模式處理Table 1　Treatment of manganese tailing and plant community in pilot scale simulation test

表 2　錳礦渣重金屬元素含量和養(yǎng)分狀況Table 2　Nutrient and heavy metal content of the manganese tailing

表 3　有機(jī)菌肥配置Table 3　Composition of the organic bacterial manure

1.2　土樣采集與測(cè)定

抖落各裝置每種植物的根際土壤，標(biāo)記為該植物根際土，每種植物需200 g鮮土；按裝置取50 g左右各植物根際鮮土混合，組成根際混合土，4個(gè)裝置即有4個(gè)根際混合土；每份土壤樣本一分為二，一份自然風(fēng)干，一份置于-80 ℃下冷凍保存，用于分析土壤微生物數(shù)據(jù)。

土壤重金屬含量：稱取0.5 g（過100目）土壤樣品置于150 mL三角瓶中，用少量超純水潤(rùn)濕樣品，蓋上彎頸漏斗，打開通風(fēng)廚，在廚內(nèi)向三角瓶均加入10 mL王水（鹽酸∶硝酸=3∶1），輕輕搖勻，靜置過夜。次日，置于電熱板上，從160 ℃開始每半小時(shí)升溫5 ℃，溶液塊干時(shí)，取下冷卻。加入3 mL高氯酸，從200 ℃開始加熱每半小時(shí)升溫5 ℃，至三角瓶中呈灰白色糊狀取下冷卻。用超純水過濾至50 mL容量瓶，定容，用原子吸收測(cè)定土壤樣品中Mn、Pb、Cd、Cu、Zn的含量。

土壤pH值：采用電位法測(cè)定土壤pH值。

土壤陽離子交換量：氯化鋇-硫酸強(qiáng)迫交換法[13]。

1.3　土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。4個(gè)裝置土壤每份由4個(gè)平行組成，共16個(gè)土壤樣本的具體操作步驟如下：將適量的土壤以10 000 r/min 離 心 5 min，使 用 E.Z.N.A.?DNA試劑盒提取基因組DNA。提取的基因組DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，然后使用引物338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3） 和 806R（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）進(jìn)行PCR 擴(kuò) 增[14]。 用 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物純化后在Illumina Miseq PE250平臺(tái)上測(cè)序。

2　結(jié)果與分析

2.1　土壤重金屬含量和理化性質(zhì)

從不同植物模式的土壤理化性質(zhì)（見表4）來看，有一定差異，如pH值和陽離子交換量，在1號(hào)裝置的土壤pH值與陽離子交換量均稍低于4號(hào)系統(tǒng)，表明復(fù)合植物模式會(huì)對(duì)系統(tǒng)土壤產(chǎn)生一定的酸化作用，這可能與植物根際分泌的有機(jī)酸相關(guān)[15]。2號(hào)和3號(hào)裝置土壤的pH值與陽離子相差最大，說明植物群落組成對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響要強(qiáng)于有機(jī)菌肥。

各裝置試驗(yàn)結(jié)束時(shí)土壤重金屬的總含量見表5，4個(gè)裝置土壤基質(zhì)的Mn、Cd、Pb、Cu、Zn總量均遠(yuǎn)超湖南省背景值和中國(guó)背景值，說明裝置土壤重金屬濃度高且屬?gòu)?fù)合型重金屬污染。其中2號(hào)和3號(hào)系統(tǒng)土壤的各元素重金屬總量均顯著小于1號(hào)和4號(hào)系統(tǒng)，這是由于有機(jī)菌肥中的有機(jī)物質(zhì)是有效的重金屬絡(luò)合劑，其可通過形成不溶性金屬-有機(jī)復(fù)合物、增加土壤陽離子交換量（CEC）、降低土壤中重金屬的水溶態(tài)及可交換態(tài)組分，從而降低土壤中重金屬的生物有效性[16]。另一方面也可能由于2號(hào)和3號(hào)系統(tǒng)基質(zhì)中添加了一定比例的有機(jī)菌肥改良劑，從而稀釋了土壤重金屬總量。土壤理化性質(zhì)和重金屬含量的這些變化也可能會(huì)影響細(xì)菌群落的組成和豐度，這將通過高通量測(cè)序技術(shù)做進(jìn)一步檢驗(yàn)。

表 4　各裝置土壤 pH 值和陽離子交換量Table 4　Soil pH value and CEC of rooting soil in pilot scale simulation test

表 5　各裝置土壤重金屬總含量?Table 5　Soil heavy metal content in pilot scale simulation test　　　(mg·kg-1)

2.2　細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性

2.2.1樣本測(cè)序結(jié)果及取樣深度驗(yàn)證

對(duì)1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)裝置的16個(gè)土壤樣本細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果表明：共獲得有效序列150 703個(gè)，97%相似水平下4個(gè)處理的測(cè)序覆蓋率都接近0.98，說明目前的序列閱讀數(shù)足以表達(dá)這些土壤中的細(xì)菌的多樣性。97%相似水平下的OTU共789個(gè)，其中3號(hào)OTU數(shù)目最多，1號(hào)最少（見表6）。采用sobs指數(shù)（實(shí)際觀測(cè)到的物種數(shù)目）構(gòu)建的稀釋曲線（如圖1）所示，16個(gè)樣本的稀釋曲線最終均趨向于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種，測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息，可以滿足分析要求[17]。

表 6　各樣本的有效序列數(shù)、序列覆蓋率及OTUs數(shù)Table 6　Reads, coverage and OTUs numbers of bacteria sequences in different samples

圖1　各樣本的稀釋曲線Fig. 1　Rarefaction curves of different samples

2.2.2細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析

以α多樣性分析反映裝置土壤中細(xì)菌群落的多樣性與豐富度，以Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)描述樣品的多樣性，以Ace指數(shù)和Chao指數(shù)描述細(xì)菌群落豐富度[18-20]。如表7所示，樣本間的豐富度指數(shù)差異顯著（P＜0.05），2號(hào)和3號(hào)的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均顯著高于1號(hào)和4號(hào)，表明有機(jī)菌肥能顯著提高土壤細(xì)菌的物種豐富度和多樣性，而這4種指數(shù)在2號(hào)與3號(hào)之間的差異并不明顯，表明植物群落組成對(duì)土壤細(xì)菌的影響較小。

表 7　各裝置的細(xì)菌豐富度及多樣性指數(shù)Table 7　Richness and diversity indexes of bacteria in all treatments

2.2.3細(xì)菌群落組成

在門分類水平上，4裝置土壤的細(xì)菌群落分布在34個(gè)細(xì)菌門。其中相對(duì)豐度較大的為以下10個(gè)門類：變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、Acitnobacteria門、擬桿菌門Bacteroidetes、Saccharibacteria門、Parcubacteria門、藍(lán)藻門Cyanobacteria、Latescibacteria門、硝化螺旋菌門Nitrospirae和Microgenomates門，它們的相對(duì)豐度之和在1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)裝置的土壤中分別占據(jù)細(xì)菌總量的98.2%、98.4%、99.7和98.7%。Parcubacteria門、藍(lán)藻門Cyanobacteria、Latescibacteria門、硝化螺旋菌門Nitrospirae和Microgenomates門等其它27個(gè)細(xì)菌門在各裝置土壤中的組成分布有所差異，但其相對(duì)豐度極小，在6.1%至9.0%范圍內(nèi)。由圖2可知，各裝置土壤中的優(yōu)勢(shì)門均為變形菌門，相對(duì)豐度分別達(dá)到了32.4%、38.5%、34.9%和34.3%。其次是酸桿菌門，相對(duì)豐度分別為11.7%、13.8%、20.4%和8.5%。在未施加有機(jī)菌肥的1號(hào)和4號(hào)裝置中各菌門的相對(duì)豐度差異較小，而對(duì)比1號(hào)和2號(hào)可以發(fā)現(xiàn)有機(jī)菌肥增加了變形菌門、酸桿菌門、Acitnobacteria門、Parcubacteria門和硝化螺旋菌門的相對(duì)豐度，增幅在0.4%～6.1%范圍內(nèi)。在施加了有機(jī)菌肥的2號(hào)和3號(hào)裝置中變形菌門、酸酐菌門和Saccharibacteria門的相對(duì)豐度差異最為顯著，其中單一植物群落下的酸酐菌門和Saccharibacteria門的相對(duì)豐度得到了增加，分別增加了6.6%和4.3%，而變形菌門的相對(duì)豐度則降低了6.3%。

圖2　各裝置細(xì)菌類群在門分類水平上的比較Fig. 2　Comparison of bacteria community in all treatments at phylum level

在綱分類水平上，各裝置土壤的細(xì)菌群落共分布在81個(gè)細(xì)菌綱。圖3顯示了4裝置土壤中相對(duì)豐度最大的9個(gè)已知綱類，分別為：變形菌綱Alphaproteobacteria、酸酐菌綱Acidobaceria、 芽單胞菌綱Gemmatimonadetes、β-變形菌綱Betaproteobacteria、 放線菌綱Actinobacteria、 厭氧繩菌綱 Anaerolineae、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、Δ-變 形 菌 綱Deltaproteovbacteria和鞘脂桿菌綱Sphingobacteriia。在這9個(gè)菌綱中β-變形菌綱、放線菌綱、Δ-變形菌綱和鞘脂桿菌綱之間的相對(duì)豐度并沒有顯著的差異（P＞0.05），而變形菌綱、酸酐菌綱、芽單胞菌綱、厭氧繩菌綱和γ-變形菌綱之間的相對(duì)豐度則差異顯著（P＜0.05）。值得注意的是不同類別的變形菌綱均會(huì)對(duì)是否施加有機(jī)菌肥以及不同的植物群落做出不同的響應(yīng)。在未施加有機(jī)菌肥的1號(hào)和4號(hào)裝置土壤中芽單胞菌綱、β-變形菌綱和厭氧繩菌綱的相對(duì)豐度均高于施加了有機(jī)菌肥的3號(hào)和4號(hào)（圖3 C、D和F）。雖然1號(hào)裝置與4號(hào)裝置土壤中各綱類的相對(duì)豐度差異不大，但酸酐菌綱、放線菌綱、厭氧繩菌綱、γ-變形菌綱和鞘脂桿菌綱的相對(duì)豐度仍在復(fù)合植物群落處理中（1號(hào)）得到了提高，增幅在0.27%～2.58%（圖3 B、E、F、G和I）。在有機(jī)菌肥處理的2號(hào)和3號(hào)裝置中變形菌綱、酸酐菌綱、放線菌綱和鞘脂桿菌綱的相對(duì)豐度均得到了顯著提高（圖3 A、B、E和I）。此外對(duì)比1號(hào)和2號(hào)不難發(fā)現(xiàn)有機(jī)菌肥的添加能提高變形菌綱、酸酐菌綱、放線菌綱、Δ-變形菌綱和鞘脂桿菌綱的相對(duì)豐度，其中變形菌綱的相對(duì)豐度得到了大幅增加，增加了8.04%（圖3 A、B、E、H和I）。在施加了有機(jī)菌肥的2號(hào)和3號(hào)裝置中變形菌綱、酸酐菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱的相對(duì)豐度差異最為顯著，其中單一植物群落下的酸酐菌綱和β-變形菌綱的相對(duì)豐度得到了增加分別增加了6.6%和2.3%，而變形菌綱和γ-變形菌綱的相對(duì)豐度則分別降低了4.5%和1.3%（圖3 A、B、D和G）。

圖3　各裝置細(xì)菌類群在綱分類水平上的比較Fig. 3　Comparison of bacteria community in all treatments at class level

2.2.4各樣本細(xì)菌群落間的關(guān)系

如圖4所示，樣本通過降維分析后，在主成分上有相對(duì)坐標(biāo)點(diǎn)，各個(gè)樣本點(diǎn)的距離代表了樣本的距離，平面上同一區(qū)域的樣本表明其具有相似性。在綱水平上PCA分析表明不同處理中細(xì)菌群落明顯分離，代表各裝置微生物相關(guān)的主成分1(PC1)、主成分2(PC2)可分別解釋變量方差的46.32%和28.82%，有機(jī)菌肥處理下的2號(hào)與3號(hào)細(xì)菌群落最相似，而未施加有機(jī)菌肥的1號(hào)與4號(hào)細(xì)菌群落最相似。

2.2.5細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

圖4　基于綱水平的PCA分析結(jié)果展示Fig. 4　Principal component analysis of in all treatments at class level

各裝置細(xì)菌群落與環(huán)境因子在綱水平上的RDA分析結(jié)果見表8和圖5。由表8知：在排序圖中，前兩軸累計(jì)解釋了86.02%的物種-環(huán)境關(guān)系信息和64.03%的物種變化信息，所選的環(huán)境因子共解釋了76.1%的物種變化信息；軸Ⅰ和軸Ⅱ的特征值分別為0.562 5、0.077 8。利用Monte Carlo置換檢驗(yàn)，向前引入法對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行逐步篩選，結(jié)果見圖5。由圖5可知，土壤錳離子濃度是造成細(xì)菌群落產(chǎn)生變化的主要因素。各環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的排序?yàn)椋篗n2+＞ Cd2+＞ Cu2+＞Pb2+＞ pH 值 ＞ Zn+＞ CEC。

表 8　各裝置細(xì)菌群落綱類RDA統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 8　Summary of redundancy analysis (RDA) of bacterial community for the first two axes

圖5　細(xì)菌群落綱類、土壤重金屬濃度、pH值與陽離子交換量的冗余分析Fig. 5　RDA analysis between bacterial classes, heavy metal content, pH value and CEC

3　討論與結(jié)論

有機(jī)菌肥作為一種微生物肥料不僅具備有機(jī)肥效應(yīng)，還是一種良好的土壤改良劑[21]。本研究結(jié)果顯示，施用了有機(jī)菌肥的2號(hào)(復(fù)合植物-有機(jī)菌肥)與3號(hào)(單一植物-有機(jī)菌肥)裝置土壤各元素的重金屬總量均顯著下降（見表5）。研究表明，有機(jī)菌肥中的吸附介質(zhì)和有機(jī)物料本身就是一種良好的土壤緩釋劑，這些物質(zhì)能活化或鈍化土壤重金屬，緩解土壤重金屬毒性。如有機(jī)物料中的大分子腐殖質(zhì)和水溶性有機(jī)物能與土壤膠體或土壤溶液的重金屬形成穩(wěn)定絡(luò)合物，進(jìn)而降低了重金屬元素的絡(luò)合性，鈍化土壤重金屬[22]。而有機(jī)菌肥中的抗性菌株雖不能直接引起土壤重金屬和理化性質(zhì)的改變，但其能與植物產(chǎn)生協(xié)同作用。如抗性芽孢桿菌能刺激植物根系分泌H+，降低土壤pH值，置換土壤顆粒表面吸附的金屬離子[23]；膠質(zhì)芽孢桿菌分泌的小分子有機(jī)酸可溶解土壤中沉淀的重金屬化合物[24]。

土壤的高度異質(zhì)性使之成為地球上最為多樣化的微生物棲息地之一[25-26]。有機(jī)菌肥對(duì)土壤的可利用性、土壤pH值、水分、養(yǎng)分等的影響可能會(huì)增加土壤微粒之間的差異，使土壤均質(zhì)化，從而提升根際微生物群落的豐富度[27]。有機(jī)菌肥所引起的根際細(xì)菌群落的變化已被多次報(bào)道[28-29]。在本研究中，施用有機(jī)菌肥后顯著提高了2號(hào)和3號(hào)植物根際區(qū)域的細(xì)菌多樣性（表7）。根際細(xì)菌多樣性的提高是有機(jī)菌肥引入了一定數(shù)量細(xì)菌的結(jié)果。有機(jī)菌肥中的土著抗性菌株主要由細(xì)菌組成，菌肥施用后其中的有機(jī)肥原料也會(huì)吸引大量異養(yǎng)細(xì)菌于土壤中定殖[30]。另一方面，細(xì)菌的生長(zhǎng)速率和生物量也會(huì)受金屬離子濃度的影響[31]。

一般來說，重金屬毒性會(huì)作用于一部分抗性較低的微生物，減少它們的豐度[28]，如變形菌門和酸桿菌門，有研究報(bào)道它們的豐度與重金屬濃度呈負(fù)相關(guān)[32]。另一方面，重金屬也會(huì)增加一些金屬抗性細(xì)菌的豐度，如本研究中所發(fā)現(xiàn)的放線菌綱和變形菌綱的一些細(xì)菌（圖3）。這些細(xì)菌已被鑒定為重金屬污染土壤中的優(yōu)勢(shì)菌，在其中發(fā)揮某些特定作用[33-34]。放線菌綱是高濃度重金屬污染水平下植物群落根際最為重要的差異菌門。它在之前的研究中已被認(rèn)定為定殖在植物根際的最為重要的一類微生物[35]。放線菌綱的很多成員可以產(chǎn)生IAA以促進(jìn)植物生長(zhǎng)、分泌鐵載體與Mn形成穩(wěn)定的配合物、幫助植物抵御病原性真菌等[36]。與之不同的是，變形門作為有機(jī)施肥后的優(yōu)勢(shì)菌種，有研究報(bào)道它的豐度與土壤中重金屬的含量、植物生物量和重金屬積累量均呈顯著正相關(guān)[37]。雖然這里并沒有直接的方法證明，但我們推測(cè)它很可能在污染土壤重金屬的植物提取效率的提高中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步鑒定和研究這種特異細(xì)菌種屬以及其他一些在超積累型根際發(fā)現(xiàn)的重要菌群，揭示其功能和相關(guān)機(jī)制，將有助于重金屬污染土壤生物修復(fù)技術(shù)的優(yōu)化。

本研究主要的結(jié)論如下：

有機(jī)菌肥能顯著地降低土壤重金屬濃度，緩解土壤重金屬毒性；

施用有機(jī)菌肥引入了一定數(shù)量的細(xì)菌，單一和復(fù)合植物模式根際細(xì)菌的多樣性和豐富度得到了顯著提升。根際的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為變形菌門，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱為變形菌綱、酸酐菌綱；

土壤重金屬毒性、土壤pH值、陽離子交換量等均能引起根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中土壤錳離子濃度對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大。