方　娟,李文鮮,黃小蘭

(重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,重慶 401120)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，占女性腫瘤的第一位，全世界乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢[1]。臨床放化療、靶向分子治療、生物治療在一定程度上提高了乳腺癌的治療效果，大大提高了患者生活質(zhì)量和生存期，但臨床的三陰性[雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和原癌基因Her-2均為陰性]乳腺癌的治療效果往往不佳，無有效的治療手段，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[2-5]。

臨床三陰性乳腺癌患者約占所有乳腺癌患者的20%。三陰性乳腺癌惡性程度高，侵襲轉(zhuǎn)移能力強，患者預(yù)后往往不良，死亡風(fēng)險很高。在傳統(tǒng)的放、化療等治療手段效果不好的情況下，乳腺癌的生物基因治療可能是最有效的手段。文獻(xiàn)報道轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/SMAD2/3信號通路在乳腺癌中處于激活狀態(tài)，TGF-β信號通路的激活是乳腺癌生長、侵襲、轉(zhuǎn)移的一個重要原因[6]。因此抑制其信號通路的激活，可抑制乳腺癌的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移過程。ALK5作為TGF-β/SMAD信號通路中重要的受體，阻斷ALK5可有效抑制TGF-β/SMAD信號通路的激活，從而抑制乳腺癌生長、侵襲、轉(zhuǎn)移[7-10]。本課題研究顯性負(fù)性突變ALK5(DNALK5)受體對三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖能力的影響，以及可能涉及作用的靶基因，為實現(xiàn)ALK5基因治療提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株和腺病毒載體乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、乳腺癌MCF7細(xì)胞、乳腺癌T47D細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-3細(xì)胞、乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞、乳腺癌MD-MB-453細(xì)胞、MD-MB-468細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供，DNALK5腺病毒、RFP腺病毒由本室構(gòu)建，并保存。

1.2主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)液(美國Life公司)；胎牛血清(美國Corning公司)；RNAiso plus、反轉(zhuǎn)錄試劑、熒光定量PCR試劑(大連寶生生物技術(shù)公司)； MTT檢測試劑(美國Sigma公司)；PCR引物(南京金斯瑞物生物技術(shù)有限公司)；蛋白質(zhì)提取裂解液和western blot檢測試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京英格恩生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體(#3700)和兔抗人SMAD2/3(#8685)購自美國Cell Signaling公司；兔抗人p-SMAD2/3多克隆抗體(ab63399)、鼠抗人ID1單克隆抗體(ab66495)和兔抗人CyclinD1單克隆抗體(ab134175) 購自美國Abcam公司。

1.3熒光定量PCR引物的設(shè)計登錄PubMed找到基因的相關(guān)序列，將基因序列輸入Premier 5引物設(shè)計軟件，得到相應(yīng)引物，選擇評分最高者，并進行BLAST 引物比對，確保引物的特異性，具體引物如下： ALK5上游引物5′-AGAGCTGTGAAGCCTTGAAGA -3′ ，下游引物5′- TGATGCCTTCCTTGTTGACTG- 3′；GAPDH上游引物5′- CAGCGACACCCACTCCTC-3′，下游引物5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′；ID1上游引物5′-CTCTACGACATGAACGGCTGT-3′，下游引物5′-TGCTCACCTTGCGGTTCTG-3′；CyclinD1上游引物5′- AACACATCATCCCCAAACAC-3′，下游引物5′-TCACACTTCATCACTCTGGA -3′。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組乳腺癌MCF7細(xì)胞、乳腺癌T47D細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-3細(xì)胞、SK-BR-3細(xì)胞、乳腺癌MDA-MB-231采用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，乳腺癌MD-MB-453細(xì)胞、MD-MB-468細(xì)胞采用10%胎牛血清的L15培養(yǎng)液培養(yǎng)，無CO2。乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長到70%～80%密度時，用胰酶(0.25%)消化、傳代，繼續(xù)培養(yǎng),實驗分為3組,空白對照組(MDA-MB-231組),實驗對照組RFP腺病毒感染MDA-MB-231(RFP組)，實驗組DNALK5腺病毒感染MDA-MB-231(AdDNALK5組)，其中RFP組和DNALK5組的腺病毒感染效率保持一致，感染率約為70%。

1.5熒光定量PCR檢測ALK5受體在MDA-MB-231中表達(dá)用RNAiso plus提取各乳腺癌細(xì)胞系及MDA-MB-231各組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以cDNA為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測各乳腺癌細(xì)胞系A(chǔ)LK5基因的表達(dá)。PCR擴增條件：預(yù)變性98 ℃10 s；變性98 ℃ 10 s，退火58 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，用2-ΔΔCT表示基因的相對表達(dá)量。

1.6MTT檢測細(xì)胞增殖改變1×105個/mL的細(xì)胞密度，按100 μL每孔細(xì)胞懸液接種于96孔板，每組設(shè)平行孔5個。細(xì)胞貼壁12 h后，將DNALK5腺病毒和RFP腺病毒分別感染MDA-MB-231，病毒感染8 h更換為含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，病毒感染24 h后開始用MTT試劑檢測各孔細(xì)胞的吸光度值，整個實驗連續(xù)監(jiān)測5 d,并根據(jù)吸光度值繪制其增殖曲線圖。

1.7western blot檢測DNALK5對TGF-β/SMAD信號通路改變MDA-MB-231接種于直徑10 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時，分別加入DNALK5和RFP腺病毒，8 h后換成1%胎牛血清的L15培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗兩次，加入1 mL PBS于培養(yǎng)皿中，用細(xì)胞刮將細(xì)胞全部刮下，并收集于1.5 mL EP管中，800×g離心5 min后，倒掉上清液，加入250 μL RIPA阿聯(lián)可冰上裂解細(xì)胞，30 min。 4 ℃，12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5 mL EP管中，BCA法檢測蛋白水平。取20 μL細(xì)胞蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠5%，分離膠10%)，濕轉(zhuǎn)PVDF膜，5%牛血清清蛋白37 ℃封閉1 h，滴加相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，然后用TBST洗膜15 min×3次，滴加相應(yīng)的二抗于室溫孵育1 h，TBST洗膜15 min×3次，最后加入ECL顯色液在GEL EQ上成像。

2　結(jié)　　果

2.1ALK5在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)熒光定量PCR法檢測ALK5在轉(zhuǎn)移能力不同的乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ALK5在惡性程度最高的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)最高，相對表達(dá)量(2-ΔΔCT)=0.95±0.06，見圖1。

2.2DNALK5對MDA-MB-231增殖改變顯性負(fù)性突變的ALK5腺病毒(AdDNALK5)感染MDA-MB-231后，第3天AdDNALK5組細(xì)胞的吸光度值為0.35±0.04，明顯低于RFP組(0.58±0.06)和空白對照MDA-MB-231組(0.61±0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。第5天AdDNALK5組細(xì)胞的吸光度值為0.49±0.06，明顯低于RFP組(0.93±0.07)和MDA-MB-231組(0.97±0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3DNALK5對MDA-MB-231細(xì)胞周期改變采取流式細(xì)胞術(shù)檢測AdDNALK5感染MDA-MB-231 3 d后MDA-MB-231細(xì)胞周期改變。AdDNALK5組細(xì)胞周期G0期占(85±9)%，明顯低于RFP組的G0期[(61±8)%]和MDA-MB-231組的G0期[(65±6)%]比例。

圖1　　ALK5在不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)

圖2　　DNALK5對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

2.4DNALK5對ID1、CyclinD1基因和蛋白表達(dá)改變通過熒光定量PCR和western blot檢測ID1、CyclinD1 mRNA和蛋白的改變，AdDNALK5組ID1 和CyclinD1 mRNA相對于RFP組的表達(dá)量(2-ΔΔCT)分別為0.45和0.52。western blot檢測AdDNALK5組ID1 和CyclinD1蛋白的改變，得到與mRNA一致的結(jié)果。見圖3。

圖3　DNALK5對MDA-MB-231細(xì)胞周期相關(guān)ID1和CyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)改變

2.5DNALK5對MDA-MB-231 TGF-β/SMAD信號通路的影響AdDNALK5感染MDA-MB-231后，可抑制TGF-β/SMAD信號通路，western blot檢測其對TGF-β/SMAD信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)SMAD2/3總的蛋白無改變，但AdDNALK5組SMAD2/3磷酸化蛋白表達(dá)明顯低于RFP和MDA-MB-231組，見圖4。

圖4　DNALK5對MDA-MB-231 TGF-β/SMAD信號通路的關(guān)鍵蛋白SMAD2/3總蛋白和磷酸化蛋白的改變

3　討　　論

乳腺癌作為女性常見的惡性腫瘤，一直是研究熱點，尤其是三陰性乳腺癌的治療是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。有文獻(xiàn)報道TGF-β/SMAD信號通路的持續(xù)激活促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[11]。如果能抑制TGF-β/SMAD信號通路的激活，將在一定程度上促進乳腺癌向良性過程轉(zhuǎn)變。ALK5作為TGF-β膜結(jié)合受體，抑制ALK5的表達(dá)，將抑制TGF-β/SMAD信號通路的激活[12]。顯性負(fù)性突變技術(shù)是一種基因工程技術(shù)，通過構(gòu)建膜蛋白的胞外域結(jié)構(gòu)，突變型的受體能夠與野生型受體競爭性結(jié)合TGF-β配體，使信號不能通過TGF-β/SMAD傳到核內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控。因此，顯性負(fù)性突變技術(shù)是腫瘤生物治療的一種良好技術(shù)，顯示其良好優(yōu)勢。顯性負(fù)性突變技術(shù)和腺病毒感染技術(shù)能夠?qū)θ橄侔嵭杏行У纳镏委煛?/p>

本研究系統(tǒng)分析ALK5在轉(zhuǎn)移能力不同的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ALK5在乳腺癌中普遍表達(dá)，在三陰性乳腺癌MDA-MB-231中發(fā)現(xiàn)DNALK5能夠顯著抑制MDA-MB-231的增殖，其DNALK5腺病毒感染MDA-MB-231后，第3天吸光度值(0.35±0.04)明顯低于RFP組(0.58±0.06)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也顯示細(xì)胞周期為G0期阻滯。進一步深入其作用機制發(fā)現(xiàn)DNALK5確實能抑制TGF-β/SMAD信號通路的激活，而且能下調(diào)其靶向基因ID1的表達(dá)。通過體外實驗證實DNALK5阻斷TGF-β/SMAD信號通路，能夠在mRNA和蛋白水平抑制ID1表達(dá)，其機制主要就是通過下調(diào)磷酸化SMAD2/3表達(dá)來實現(xiàn)的。本研究在一定程度上找到治療三陰性乳腺癌的基因治療方法，但其在體內(nèi)作用如何今后還將進行深入研究。