李美，楊正海，李小寧

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241000)

由于臨床存在不規(guī)范抗結(jié)核治療和現(xiàn)有抗結(jié)核藥物不合理使用現(xiàn)象，以及新型抗結(jié)核藥物的研究進(jìn)展緩慢，出現(xiàn)結(jié)核桿菌尤其是耐多藥(MDR-TB)結(jié)核桿菌的播散，導(dǎo)致結(jié)核病的治療和防控難度增加，發(fā)病率、耐藥率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢。因此本文就本地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和4種一線抗結(jié)核藥物進(jìn)行敏感試驗(yàn)，旨在為臨床合理用藥、評價(jià)化療方案及耐藥結(jié)核病的疫情監(jiān)測和有效防控耐藥結(jié)核的蔓延提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源

對我院2014年1月至2015年8月期間送檢的無重復(fù)標(biāo)本709份。其中男性514例，女性195例,年齡9～88歲。

1.2菌株來源

痰標(biāo)本采用液體培養(yǎng)法(BD公司320結(jié)核培養(yǎng)儀)，培養(yǎng)陽性標(biāo)本經(jīng)膠體金法鑒定為結(jié)核分枝桿菌(結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒購自杭州創(chuàng)新生物檢驗(yàn)技術(shù)有限公司)。

1.3藥敏試驗(yàn)

分別對4種一線抗結(jié)核藥物SM、INH、RFP、EMB進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，含藥培養(yǎng)基中，藥物濃度SM 1.0 μg/mL、INH 0.1 μg/mL、RFP 1.0 μg/mL、EMB 5.0 μg/mL。將培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的菌液，用無菌生理鹽水按照1∶100(50 μL菌液:5 mL生理鹽水)的比例稀釋，取0.5 mL稀釋菌液接種于對照培養(yǎng)基，分別再取0.5 mL菌原液接種至各種含藥培養(yǎng)基內(nèi)，置結(jié)核培養(yǎng)儀培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.4結(jié)果判定

計(jì)算耐藥百分比，以在臨界藥物濃度生長菌落的百分?jǐn)?shù)來表示菌株耐藥性，即含藥培養(yǎng)基菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)的百分比，<1%為敏感，≥1%為耐藥。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用Z檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1總體耐藥結(jié)果

709份送檢痰標(biāo)本中培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌共計(jì)204例(培養(yǎng)陽性率占28.8%)。對SM、INH、RFP、EMB 4種抗結(jié)核桿菌藥物耐藥64株，總體耐藥率為31.4%，有關(guān)單一藥物、2種藥物、3種藥物、4種藥物耐藥的結(jié)果分析見表1。

表1　204例陽性樣本4種一線藥物耐藥結(jié)果

2.2204例耐藥菌株對4種一線抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素耐藥率與全國水平的比較見表2。

表2　4種一線藥物耐藥率與全國水平的比較

2.3每種一線藥物的單耐藥和多耐藥菌株數(shù)的結(jié)果分析見表3。研究中發(fā)現(xiàn)沒有利福平和乙胺丁醇出現(xiàn)單耐藥現(xiàn)象；并且只要利福平耐藥，就同時(shí)異煙肼耐藥。提示只要利福平耐藥就是MDR，甚至是XDR可能。結(jié)論與WHO一致，即利福平耐藥性檢測是判斷耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的標(biāo)志。

表3　每種一線藥物的單耐藥和多耐藥菌株數(shù)的結(jié)果

3　討　　論

據(jù)2015年全球結(jié)核報(bào)告中顯示，2015年全球估算共有960萬例結(jié)核病新發(fā)患者，發(fā)病率為133/10萬，新發(fā)耐多藥結(jié)核病患者人數(shù)為48萬例，新發(fā)Mtb與HIV雙重感染患者約有120萬例。中國是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，估算的發(fā)病數(shù)為93萬例，發(fā)病率為68/10萬，發(fā)病數(shù)居世界第3位[1]。因此本文就本地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和4種一線抗結(jié)核藥物進(jìn)行敏感試驗(yàn)，4種一線藥物的耐藥率依次為INH(29.4%)>RFP(19.6%)>SM(16.7%)>EMB(12.7%)?？傮w耐藥率為31.4%,低于全國平均水平(37.79%)[2]，接近于四川省(30.4%)、浙江省(31.3%)[3]，說明本地區(qū)結(jié)核病防控措施有效。但對耐藥結(jié)核分枝桿菌的藥敏結(jié)果中，結(jié)果顯示4種一線藥物全耐藥率高達(dá)9.3%，明顯高于廣東省韶關(guān)市(6.7%)[4]，說明本地區(qū)耐多藥現(xiàn)象嚴(yán)重，應(yīng)引起重視。

從本地區(qū)204例結(jié)核病患者的主要流行特征來看(表2)，鏈霉素的耐藥率顯著低于于全國的平均水平，而利福平的耐藥率顯著高于全國平均水平，同時(shí)本地區(qū)INH和RFP耐藥占19.6%，明顯高于惠州市(12.38%)的研究資料[2]1850-1852，說明本地區(qū)MDR-TB感染的形勢嚴(yán)峻，可能是我院收治的大多是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)采用了INH和RFP為主的短期化療方案治療失敗或者是難治性結(jié)核患者，因此常規(guī)監(jiān)測INH和RFP耐藥性，特別是對復(fù)發(fā)或接受復(fù)治標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療失敗的病人定期進(jìn)行結(jié)核培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏結(jié)果及時(shí)調(diào)整、重新制訂含新藥或二線用藥的化療方案就顯得尤為重要。同時(shí)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EMB沒有出現(xiàn)單藥耐藥現(xiàn)象，但26株EMB耐藥中有多耐藥菌株 3株(占1.5%)，MDR-TB 23株(占11.3%)。只要EMB耐藥，就對INH耐藥，并且表現(xiàn)對RFP有較高比例的耐藥(88.5%)。推測結(jié)核分枝桿菌對EMB的高度耐藥性可能與INH和RFP的高度耐藥性存在一定的相關(guān)性[5]。

利福平(RFP)是結(jié)核病化療方案中的關(guān)鍵用藥，其耐藥機(jī)制主要是由rpoB 基因突變導(dǎo)致利福平不能與RNA聚合酶β亞單位結(jié)合，從而mRNA轉(zhuǎn)錄不能被抑制。本研究發(fā)現(xiàn)RFP沒有表現(xiàn)單藥耐藥現(xiàn)象，40例利福平耐藥都同時(shí)表現(xiàn)異煙肼耐藥，成為耐多藥結(jié)核(MDR-TB)菌株。雖與廣東地區(qū)(82.6%)、上海市奉賢區(qū)(60.5%)、寧波地區(qū)(85.6%)的研究結(jié)果略有不同，可能是與地域差異有關(guān)。但可以推測利福平耐藥性檢測是判斷MDR-TB的標(biāo)志。因此采用基因芯片技術(shù)( 又稱為微陣列基因芯片或DAN 微陣列) 快速檢測藥物敏感性的基因型法藥敏試驗(yàn)方法，該芯片系統(tǒng)可檢測RFP 耐藥基因rpoB6 個(gè)位點(diǎn)13 種常見的突變類型以及2 個(gè)相關(guān)INH 耐藥基因位點(diǎn)3 種突變類型，對于MDR-TB病例的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療，從而防止MDR-TB傳播，減少原發(fā)性病例的產(chǎn)生具有積極意義[6]。

總之，雖本地區(qū)結(jié)核桿菌總體耐藥率偏低，顯示結(jié)核病控制有效，但MDR-TB比率反而偏高，形勢嚴(yán)峻。因此為了防止MDR-TB的產(chǎn)生和播散，必須對結(jié)核病進(jìn)行防治結(jié)合。首先要教育宣傳，增強(qiáng)群眾對結(jié)核病的預(yù)防；其次是要加強(qiáng)消毒和防護(hù)，減少結(jié)核病的感染；最重要的是要常規(guī)檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，為臨床合理用藥和及時(shí)調(diào)整抗結(jié)核治療方案，減少耐多藥結(jié)核分枝桿菌甚至MDR、XDR的產(chǎn)生提供科學(xué)依據(jù)。