王 沖，侯 娟，芮 菁

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

KEYWORDSCompound Hongjingtian Tablet, anti- anoxia effects, anti-fatigue effects

現(xiàn)代人生活節(jié)奏快，工作壓力大，易導(dǎo)致疲憊不堪、心力交瘁等癥狀。短期癥狀經(jīng)休整可得到有效緩解，如癥狀長(zhǎng)期積累，則不易消除，輕者造成注意力不集中、抵抗力下降等，重者可致腦細(xì)胞缺氧和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，嚴(yán)重危及人體健康[1]。因此，開(kāi)發(fā)具備緩解疲勞、提高耐缺氧能力的營(yíng)養(yǎng)保健性食品，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)中藥憑借其療效確切、毒副作用小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)與潛力，正逐漸成為耐缺氧、抗疲勞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。大量文獻(xiàn)研究表明，紅景天[3]、銀杏葉[4]、天麻[5]、松花粉[6]及北五味子[7]等單味中藥對(duì)于缺氧及疲勞癥狀均具有積極的緩解作用。復(fù)方紅景天片是根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，以紅景天、雪靈芝、北五味子等多味中藥合理配伍，結(jié)合現(xiàn)代制劑方法，制成的用于緩解疲勞及缺氧癥狀的中藥復(fù)方片劑，安全性試驗(yàn)已證明其無(wú)毒性作用，本實(shí)驗(yàn)報(bào)道復(fù)方紅景天片的抗缺氧及抗疲勞效果。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，購(gòu)入時(shí)體重為15～17 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京) 2016- 0011。大、小鼠維持飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京) 2014- 0010。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(津) 2016- 0006。人工照明，12 h明/12 h暗。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于環(huán)境中適應(yīng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2試藥 復(fù)方紅景天片，為紅棕色片劑，規(guī)格為0.5 g/片，每片相當(dāng)于生藥1.96 g，天津市現(xiàn)代醫(yī)藥開(kāi)發(fā)研究所提供；亞硝酸鈉，500 g/瓶，天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；鈉石灰，500 g/瓶，上海新誠(chéng)精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；醫(yī)用凡士林，500 g/瓶，天津市華東試劑廠生產(chǎn)。血乳酸(LD)、血尿素氮(BUN)、肝/肌糖原(HG)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒均為南京建成生物工程研究所提供。

1.3儀器 酶標(biāo)儀，型號(hào)SpectiaMax M2，Molecular Devices公司生產(chǎn)；電子天平，型號(hào)BA-310S，沙多利斯公司生產(chǎn)；電子天平，型號(hào)NVL2101B/2，江蘇奧豪斯電子有限公司生產(chǎn)；恒溫水浴，型號(hào)WNB22，MEMMERT公司生產(chǎn)；離心機(jī)，型號(hào)B600B，白洋離心機(jī)廠生產(chǎn)。另有主要器械包括：剪刀、秒表、250 ml磨口瓶。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組及給藥 將280只小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組及受試物低、中、高劑量組，每組動(dòng)物70只?！?.4.2”及“1.4.3”項(xiàng)下各實(shí)驗(yàn)中每組均取10只動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)測(cè)定。復(fù)方紅景天片服用方法為2次/d，3片/次，按體質(zhì)量60 kg計(jì)，成人每日劑量為0.05 g/kg，相當(dāng)于0.196 g原生藥/kg。將人體推薦劑量的10倍設(shè)為低劑量，中、高劑量分別為人體推薦劑量的15倍及22.5倍，即低、中、高3種劑量分別為1.96、2.94、4.41 g原生藥/kg。受試物每日臨用前新鮮配制，灌胃前搖勻，按0.02 ml/g體積，1次/d，連續(xù)30 d，陰性對(duì)照組給予等體積純化水。

1.4.2耐缺氧實(shí)驗(yàn)

1.4.2.1常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 于末次灌胃給予受試物后1 h，將各組動(dòng)物分別放入盛有5 g鈉石灰的250 ml磨口瓶?jī)?nèi),每瓶1只，用預(yù)先涂有凡士林的瓶塞封瓶口，蓋嚴(yán)，使之不漏氣，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠因缺氧而死亡的時(shí)間[8]。

1.4.2.2亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn) 于末次灌胃給予受試物后1 h，將各組動(dòng)物按220 mg/kg劑量腹腔注射亞硝酸鈉(注射量0.01 ml/g)，立即計(jì)時(shí)，記錄動(dòng)物存活時(shí)間[8]。

1.4.2.3急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn) 于末次灌胃給予受試物后1 h，各組動(dòng)物自頸部逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時(shí)間[8]。

1.4.3抗疲勞實(shí)驗(yàn)

1.4.3.1力竭游泳實(shí)驗(yàn) 于末次灌胃給予受試物后1 h，稱量小鼠體重，將其自身體重5%的鉛皮捆綁于尾根部后，置小鼠于水深30 cm，水溫25 ℃的游泳箱中，強(qiáng)迫游泳至力竭。以小鼠全身沒(méi)于水面以下，8 s內(nèi)不能浮出水面判定為力竭，記錄小鼠開(kāi)始游泳至力竭時(shí)間[9]。

1.4.3.2血尿素氮測(cè)定 置小鼠于深30 cm，水溫25 ℃的游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，休息60 min后摘眼球采取全血，置4 ℃冰箱約3 h，血凝固后2 000 r/min離心15 min，取血清按照試劑盒的方法測(cè)定血尿素氮濃度[10]。

1.4.3.3血乳酸、MDA及SOD測(cè)定 置小鼠于深30 cm，水溫25 ℃的水中，不負(fù)重游泳10 min，分別在游泳前、游泳后以及休息20 min后采血進(jìn)行乳酸測(cè)定，計(jì)算小鼠血乳酸曲線下面積，計(jì)算方法為：血乳酸曲線下面積=5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0 min血乳酸值+2×游泳后休息20 min血乳酸值) 。剪取小鼠腿部?jī)?nèi)側(cè)腓腸肌，去除多余脂肪，制備10%組織勻漿，以試劑盒方法測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化水平MDA及SOD含量[10]。

1.4.3.4肝糖原及肌糖原測(cè)定 以安死術(shù)處死小鼠后，取肝臟及股四頭肌以生理鹽水漂洗，用濾紙吸干后分別精確稱取約50 mg，放入試管中，加堿液，沸水浴20 min，按照試劑盒的方法測(cè)定組織中的糖原的含量[9]。

2 結(jié)果

2.1對(duì)耐缺氧作用的影響 CHT連續(xù)灌胃給予30 d，可延長(zhǎng)常壓缺氧小鼠的存活時(shí)間，且呈明顯的量效關(guān)系。CHT高劑量組可延長(zhǎng)小鼠亞硝酸鈉中毒后的存活時(shí)間，3個(gè)劑量組均可延長(zhǎng)小鼠斷頭后的呼吸時(shí)間，與陰性對(duì)照組比較，差異具極顯著性(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 CHT對(duì)小鼠耐缺氧作用的影響

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響 CHT中、高劑量組可延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，延長(zhǎng)率分別達(dá)到25.4%及29.2%，且具有明顯的劑量依賴性，見(jiàn)表2。

表2 CHT對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

2.3對(duì)疲勞小鼠血清尿素氮及乳酸的影響 CHT中、高劑量組可降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血清尿素氮水平，高劑量組可降低血中乳酸堆積，與陰性對(duì)照組比較，差異具顯著性(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 CHT對(duì)疲勞小鼠血清尿素氮及乳酸的影響

2.4對(duì)疲勞小鼠組織MDA及SOD的影響 CHT中、高劑量組可降低小鼠運(yùn)動(dòng)后肌肉組織內(nèi)MDA含量，與陰性對(duì)照組比較，差異具顯著性(P<0.05)。CHT對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠肌肉組織中SOD含量無(wú)明顯影響，見(jiàn)表4。

表4 CHT對(duì)疲勞小鼠組織MDA及SOD的影響

2.5對(duì)小鼠肝糖原及肌糖原含量的影響 CHT高劑量組可提高小鼠肝糖原及肌糖原含量，與陰性對(duì)照組比較，差異具極顯著性(P<0.01)，見(jiàn)表5。

表5 CHT對(duì)小鼠肝糖原及肌糖原含量的影響

3 討論

常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)?zāi)M的是小鼠全身性缺氧，小鼠的存活時(shí)間可直接反應(yīng)藥物對(duì)肌體抗缺氧能力的影響；亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)?zāi)M的是急性中毒性缺氧，亞硝酸鈉可迅速破壞血紅蛋白的攜氧能力，造成組織缺氧死亡；而急性腦缺血性缺氧模擬臨床腦缺氧所產(chǎn)生的神經(jīng)退行性疾病[11]。依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003版)》判斷標(biāo)準(zhǔn)，上述3項(xiàng)耐缺氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中任意2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，就說(shuō)明該產(chǎn)品具有提高缺氧耐受性的保健功能[12]。復(fù)方紅景天片3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，提示其耐缺氧功效顯著。

缺氧和疲勞密切相關(guān)，疲勞的過(guò)程中往往伴隨有組織缺氧現(xiàn)象，若肌體攜氧、利用氧的能力強(qiáng)，可顯著緩解甚至消除疲勞，因而，具備耐缺氧能力的藥物往往同時(shí)具備抗疲勞的效果[13]。小鼠游泳力竭時(shí)間是反映動(dòng)物運(yùn)動(dòng)耐力的常用指標(biāo)，也是反映肌體疲勞程度最直觀的指標(biāo)。復(fù)方紅景天片顯著延長(zhǎng)游泳存活時(shí)間，增加小鼠的耐力，表明其對(duì)肌體疲勞具有顯著的改善作用。

運(yùn)動(dòng)中體內(nèi)蓄積的大量乳酸及血尿素氮等致疲勞物質(zhì)，是導(dǎo)致肌體疲勞的直接因子。乳酸為葡萄糖無(wú)氧酵解產(chǎn)物，尿素氮為蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝產(chǎn)物[8]。復(fù)方紅景天片可減低乳酸及血尿素氮的積累，提示加速乳酸及血尿素氮等疲勞因子的清除代謝，或?yàn)槠浒l(fā)揮延緩疲勞作用的機(jī)制之一。肌體的持續(xù)運(yùn)動(dòng)能力，取決于體內(nèi)能源物質(zhì)的儲(chǔ)備量及供氧量是否充足，在有氧狀態(tài)下，肌體首先消耗糖原為能源物質(zhì)，維持正常的血糖水平。體內(nèi)肌糖原和肝糖原儲(chǔ)備越是充足，提供運(yùn)動(dòng)所需的能量就越多，疲勞就會(huì)延遲出現(xiàn)[14]。復(fù)方紅景天片可增加糖原儲(chǔ)備，維持運(yùn)動(dòng)時(shí)間，延緩疲勞發(fā)生。肌體在運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)有大量氧自由基生成，紅細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸因受到自由基的攻擊，而產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒性的脂質(zhì)過(guò)氧化物所引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)亦是產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)疲勞的原因之一[10]。CHT對(duì)SOD無(wú)明顯影響，但可有效抑制小鼠長(zhǎng)時(shí)間疲勞性運(yùn)動(dòng)后骨骼中MDA的產(chǎn)生，提示CHT可有效阻止細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，減緩組織氧化損傷。

綜上所述，動(dòng)物連續(xù)給予復(fù)方紅景天片30 d后，可通過(guò)延長(zhǎng)小鼠耐缺氧時(shí)間和游泳時(shí)間，降低運(yùn)動(dòng)后血清尿素氮以及乳酸增量，增加小鼠肌糖原及肝糖原儲(chǔ)備，降低運(yùn)動(dòng)后組織的氧化損傷，起到良好的抗疲勞及抗缺氧作用，在職業(yè)疲勞人群和老年人群中必將具有廣闊的市場(chǎng)前景。

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