葛展霞， 鐘希娜， 朱炳海， 何 濤， 魏瑞成， 王 冉

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所/省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——食品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210014; 2.山東省陽信縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東 濱州 251800)

新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)是2009年發(fā)現(xiàn)的一種新型金屬β-內(nèi)酰胺酶, 該酶從發(fā)現(xiàn)之初就備受關(guān)注。攜帶有該酶的菌株對包括碳青霉烯類在內(nèi)的多類抗菌藥物同時(shí)表現(xiàn)為高度耐藥，并且耐藥菌可以呈洲際傳播，所以被稱為“超級細(xì)菌”，令全世界為之恐慌[1]。NDM基因的主要宿主菌為大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌，包括NDM-1到NDM-12幾個(gè)亞型，其中動物源(如雞源和奶牛源)大腸桿菌上NDM-5基因的流行率呈遞增趨勢[2-3]。目前臨床上針對NDM陽性細(xì)菌的感染，主要采取的治療措施仍是抗生素療法，即選擇對該菌敏感的非β-內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行治療，但是抗生素長期使用亦可能激發(fā)或誘導(dǎo)病原菌的進(jìn)一步超乎人類想象的變異，產(chǎn)生更為可怕的多重耐藥或泛耐藥細(xì)菌，因此，尋找一種有效的抗生素替代療法成為擺在全球科學(xué)工作者面前的重要科學(xué)問題。

噬菌體是一種殺滅細(xì)菌的病毒，寄生于細(xì)菌并利用細(xì)菌來復(fù)制繁殖，最后將細(xì)菌裂解致死，由于其天然的殺菌特性，被科學(xué)家認(rèn)為是潛在的“超級細(xì)菌的有效克星”，而噬菌體因具有對宿主細(xì)菌的高特異性，強(qiáng)大的裂解能力以及對人類和動物(產(chǎn)品)沒有毒副作用，不會產(chǎn)生藥物殘留等優(yōu)勢而顯示出比抗生素更加廣闊的應(yīng)用前景和價(jià)值[4-5]。在2000 年度Everygreen 噬菌體國際會議上，研究者報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體是有效、安全的病原體治療和生態(tài)環(huán)境凈化生物制劑[6]。本研究擬以1株攜帶NDM-5基因的雞源大腸桿菌為宿主菌，從養(yǎng)殖場污水中分離針對該耐藥大腸桿菌的裂解性噬菌體，并對其進(jìn)行生物學(xué)特性分析，以期為NDM-5陽性大腸桿菌的防控提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與污水 試驗(yàn)所用多株NDM-5陽性大腸桿菌為江蘇宿遷肉雞養(yǎng)殖場的雞糞便中分離得到，經(jīng)PCR檢測和測序確定其攜帶NDM-5基因，選擇其中1株細(xì)菌SQ-C-E5作為噬菌體分離用宿主菌。同時(shí)采集該養(yǎng)殖場的污水樣本用于分離噬菌體。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.1.2.1 LB(Luria broth)液體培養(yǎng)基(1 L) 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加ddH2O至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃，20 min高壓滅菌。

1.1.2.2 0.6% LB半固體培養(yǎng)基(1 L) 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉6 g，加ddH2O至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃，20 min高壓滅菌。

1.1.2.3 1.2% LB固體培養(yǎng)基(1 L) 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉12 g，加ddH2O至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃，20 min高壓滅菌后，冷卻至50 ℃，傾倒平板，冷卻凝固后，倒置備用。

1.1.2.4 SM緩沖液(1 L) 稱取6.055 g Tris-HCI(pH為7.5)定容至100 ml，加入5.800 g NaCl，2.000 g MgSO4后，加入ddH2O定容至1 L。

1.1.2.5 腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BHI)(1 L) 稱取37 g腦心浸液肉湯培養(yǎng)基粉末(青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品)于1 000 ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻備用。

1.1.2.6 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)(1 L) 稱取37.5 g伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基粉末(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品)于1 000 ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至55 ℃左右，混勻后傾注平板備用。

1.1.2.7 DNA試劑盒 由天根生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器 試驗(yàn)中主要用到的試驗(yàn)儀器和設(shè)備見表1。

表1 試驗(yàn)主要儀器和設(shè)備

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離及純化 將污水樣10 000 r/min離心之后取上清液，在無菌環(huán)境下經(jīng)0.22 μm濾膜過濾之后，取10 ml加入11 ml處于對數(shù)生長期(1×108CFU/ml)的大腸桿菌SQ-C-E5菌液中37 ℃培養(yǎng)12 h，將共培養(yǎng)液10 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后得到的液體，即噬菌體原液。

采用雙層平板法[7]進(jìn)行噬菌體的鑒定，取0.1 ml原液于0.9 ml SM稀釋液中稀釋，依次向后作10倍梯度稀釋，稀釋倍數(shù)至105、106后，取0.1 ml稀釋液于0.1 ml細(xì)菌中混合，靜置15 min，加入3.5 ml約50 ℃的0.6% LB半固體培養(yǎng)基，混勻后倒入1.2% LB固體培養(yǎng)基中，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察是否有噬菌斑出現(xiàn)。挑選有噬菌斑的平板進(jìn)行初步純化，從有噬菌斑的平板中挑取單個(gè)形態(tài)清晰的噬菌斑，并將其溶解于0.9 ml SM稀釋液中，振蕩均勻后，取0.1 ml液體稀釋，進(jìn)行雙層平板試驗(yàn)，重復(fù)該操作，直至噬菌斑的大小均一，得到較純的噬菌體液。

1.2.2 噬菌體效價(jià)測定 采用雙層平板法，每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù)，計(jì)數(shù)時(shí)選取噬菌斑個(gè)數(shù)為30～300的平板計(jì)數(shù)，記錄噬菌斑個(gè)數(shù)，計(jì)算噬菌體的效價(jià)。噬菌體效價(jià)(PFU/ml)=噬菌斑個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)/所取樣品體積。

1.2.3 噬菌體的電鏡形態(tài)觀察 根據(jù)余靜丹[8]的方法，將處理好的用SM稀釋液溶解的噬菌體樣20 μl滴于銅網(wǎng)中，自然沉降15 min后，用濾紙吸取多余的水分，加1滴2%的磷鎢酸于銅網(wǎng)中染色，待樣品干燥后，于透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.2.4 噬菌體基因組分析 將純化后的噬菌體液按DNA試劑盒中的方法依次進(jìn)行操作，用RNase A水溶液溶解的液體置于-20 ℃冰箱中待用。

將提取的核酸用DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease進(jìn)行處理和判斷噬菌體基因組的類型，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ 酶切，根據(jù)酶切后電泳的DNA條帶大小進(jìn)行基因組分子量大小的估算。

1.2.5 最佳感染復(fù)數(shù)測定 最佳感染復(fù)數(shù)的定義為噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。根據(jù)Lu等[9]的方法，首先，將處于對數(shù)生長期(1×108CFU/ml)的宿主菌用新鮮的 LB 液體培養(yǎng)液洗滌，然后將細(xì)菌數(shù)量調(diào)整為1.0×108CFU/ml。按照感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為 0.01、0.10、1.00、10.00 和 100.00 的比例，將相應(yīng)數(shù)量的噬菌體液加入到已準(zhǔn)備好的菌液中，混勻， 37 ℃，160 r/min 震蕩培養(yǎng)5 h。將混合培養(yǎng)物10 000 r/min離心1 min，得到裂解液。用雙層瓊脂平板法測定裂解液中噬菌體的效價(jià)，產(chǎn)生最高效價(jià)的感染復(fù)數(shù)即為最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)。同樣條件下設(shè)置3組重復(fù)試驗(yàn)，每組2個(gè)平行。

1.2.6 一步生長曲線繪制 噬菌體液與宿主菌液以最佳感染復(fù)數(shù)的比例加入到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃孵育15 min，10 000 r/min離心1 min，棄掉上清液，用新鮮的LB液體洗滌2次。加入等體積37 ℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，充分混勻，迅速置于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)。同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在0 min和每隔10 min取樣1次，采用雙層瓊脂平板法測定噬菌體的效價(jià)。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體的一步生長曲線。同樣條件下設(shè)置3組重復(fù)試驗(yàn)，每組2個(gè)平行。

1.2.7 殺菌效力測定 將過夜培養(yǎng)的宿主菌用培養(yǎng)液稀釋至 1×107CFU/ml，取18根試管，宿主對照組中加入1.5 ml稀釋后的宿主菌和1.5 ml LB培養(yǎng)液，其他試驗(yàn)組中加入1.5 ml稀釋后的宿主菌和1.5 ml不同效價(jià)的噬菌體，使其MOI值依次為0.01、0.10、1.00、10.00 和 100.00 ，每個(gè)MOI值做3個(gè)平行，每30 min測定1次OD600，測定10次。

1.2.8 熱穩(wěn)定性測定 將噬菌體放于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃水浴鍋中，分別持續(xù) 30 min和60 min 后，利用雙層平板法，待平板凝固后放于37 ℃下培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果。同樣條件下設(shè)置3組重復(fù)試驗(yàn)，每組2個(gè)平行。

1.2.9 pH穩(wěn)定性測定 調(diào)整LB液體培養(yǎng)基的pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，取不同pH值濃度的LB液體100 μl，加入100 μl噬菌體液混勻，37 ℃作用2 h。從每管中各取100 μl，鋪雙層瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)，測定噬菌體的效價(jià)。同樣條件下設(shè)置3組重復(fù)試驗(yàn)，每組2個(gè)平行。

1.2.10 宿主譜分析 采用點(diǎn)樣法，測定噬菌體對不同大腸桿菌菌株的裂解情況。將30株來自江蘇宿遷3個(gè)不同雞養(yǎng)殖場的大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，其中包括了13株NDM-5陽性菌株，17株NDM-5陰性菌株，分別取100 μl涂布至1.2%固體LB培養(yǎng)基上，晾干后，將10 μl的噬菌體點(diǎn)樣至平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，觀察其對不同菌株的裂解情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離及噬菌斑特征

采用雙層平板法，多次重復(fù)試驗(yàn)步驟，得到純化后的噬菌斑，最終獲得的噬菌斑呈圓形，且噬菌斑透亮，無暈圈(圖1)，由噬菌斑可知，該噬菌體為裂解性噬菌體，將其命名為vB_EcoM_Bp5。

圖1 噬菌體vB_EcoM_Bp5噬菌斑Fig.1 Plaques of bacteriophage vB_EcoM_Bp5

2.2 噬菌體透射電鏡形態(tài)

噬菌體vB_EcoM_Bp5經(jīng)負(fù)染后，于電鏡下觀察后的電鏡圖見圖2，該噬菌體的頭部為多面體，直徑約80 nm，有可伸縮長尾，尾部長約90 nm，直徑約為20 nm，有少量尾絲清晰可見，按國際病毒分類委員會分類規(guī)則[10]，將其歸為有尾噬菌體目，肌尾病毒科。

圖2 噬菌體vB_EcoM_Bp5透射電鏡形態(tài)Fig.2 Morphology of bacteriophage vB_EcoM_Bp5 in transmission electron microscope

2.3 噬菌體基因組分析

泳道M1和M2分別為23 kb Marker 和 15 kb Marker，泳道1為噬菌體vB_EcoM_Bp5基因組，泳道2和3分別為噬菌體vB_EcoM_Bp5基因組被EcoR I 和Hind III消化后的產(chǎn)物。

噬菌體vB_EcoM_Bp5基因組只可以被DNase I消化，而不可以被RNase A和Mung bean nuclease消化，說明該噬菌體基因組為dsDNA(雙鏈DNA)。由圖3可知，通過對噬菌體基因組進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切片段與DNA marker的條帶比對，噬菌體的基因組分子量大小約為50 kb，其確切的分子量大小還需要通過全基因組測序才能確定。

圖3 噬菌體vB_EcoM_Bp5基因組酶切圖譜Fig.3 Electrophoresis of bacteriophage vB_EcoM_Bp5 genome

2.4 最佳感染復(fù)數(shù)

由表2可知，當(dāng)MOI為10時(shí)，噬菌體vB_EcoM_Bp5感染SQ-C-E5后的噬菌體效價(jià)為1.6×1011PFU/ml，與其他感染復(fù)數(shù)作用下的噬菌體效價(jià)相比，MOI為10時(shí)，噬菌體效價(jià)最高，因此，噬菌體vB_EcoM_Bp5的最佳MOI為10。

表2 噬菌體vB_EcoM_Bp5最佳MOI的測定

2.5 一步生長曲線

由圖4可知，噬菌體vB_EcoM_Bp5在感染宿主菌后效價(jià)在5 min內(nèi)無明顯變化，即潛伏期為5 min，爆發(fā)期大約持續(xù)65 min，在70 min后噬菌體數(shù)量趨于平穩(wěn)。噬菌體的初期數(shù)量5.0×105PFU/ml，裂解末期噬菌體數(shù)量平均值為6.8×107PFU/ml，根據(jù)裂解量=裂解末期噬菌體平均數(shù)量/感染初期細(xì)菌數(shù)量可知，噬菌體vB_EcoM_Bp5的裂解量為136。

圖4 噬菌體vB_EcoM_Bp5一步生長曲線Fig.4 One-step growth curve of vB_EcoM_Bp5

2.6 噬菌體殺菌效力

由圖5可知，當(dāng)噬菌體vB_EcoM_Bp5與宿主菌感染復(fù)數(shù)為0時(shí)，表示培養(yǎng)液內(nèi)僅含有細(xì)菌，沒有噬菌體，其在5 h內(nèi)，OD600呈上升趨勢，而在感染復(fù)數(shù)為0.01，0.10，1.00，10.00，100.00時(shí)，OD600都有不同程度的下降，并且無上升的過程，最后趨于穩(wěn)定，表明噬菌體vB_EcoM_Bp5的殺菌效果明顯，在感染初期，能有效抑制細(xì)菌的生長，并在后期完全抑制細(xì)菌生長，甚至可以完全清除細(xì)菌。在不同的感染復(fù)數(shù)下，其下降的幅度是不一樣的，當(dāng)感染復(fù)數(shù)達(dá)到10時(shí)，其對宿主菌的裂解效果最明顯。

圖5 噬菌體vB_EcoM_Bp5裂解細(xì)菌的動態(tài)曲線Fig.5 Lytic kinetics of bacteriophage vB_EcoM_Bp5

2.7 熱穩(wěn)定性

由圖6可知，噬菌體vB_EcoM_Bp5在溫度條件為30 ℃、40 ℃、50 ℃時(shí)，隨時(shí)間推移，其效價(jià)并沒有發(fā)生明顯的變化，而在60 ℃時(shí)，噬菌體效價(jià)開始下降，并且溫度越高，作用時(shí)間越長，活力下降越明顯。在80 ℃時(shí)，噬菌體效價(jià)為零，表明在此溫度下，噬菌體的活力受到了嚴(yán)重的破壞?？芍?，噬菌體vB_EcoM_Bp5的最適溫度為30～60 ℃。

圖6 噬菌體vB_EcoM_Bp5溫度耐受能力Fig.6 Tolerance to temperatures of vB_EcoM_Bp5

2.8 pH穩(wěn)定性

由圖7可知，噬菌體vB_EcoM_Bp5在pH為5～10時(shí)，噬菌體的活力較穩(wěn)定，當(dāng)pH小于5或大于10時(shí)，噬菌體的活力下降明顯，在pH≤3或≥11時(shí)，噬菌體處于失活狀態(tài)，表明該噬菌體在強(qiáng)酸，強(qiáng)堿的條件下無法存活。由此可知，該噬菌體的最適pH范圍為5～10。

圖7 噬菌體vB_EcoM_Bp5酸堿耐受能力Fig.7 Tolerance to acidity and alkalinity of vB_EcoM_Bp5

2.9 噬菌體的裂解譜

選取30株雞源大腸桿菌進(jìn)行點(diǎn)樣，發(fā)現(xiàn)噬菌體vB_EcoM_Bp5能裂解其中的17株大腸桿菌，裂解率為56.7%，其中12株為NDM-5陽性大腸菌株，5株為NDM-5陰性大腸菌株，分別來源于場I(8株)、場II(5株)和場III(4株)3個(gè)雞養(yǎng)殖場。由此可見，噬菌體vB_EcoM_Bp5宿主譜較寬，能夠有效地裂解多株雞源NDM-5陽性大腸桿菌，同時(shí)對NDM-5陰性的大腸桿菌也有一定的裂解作用，說明噬菌體vB_EcoM_Bp5為寬宿主譜的大腸桿菌裂解性噬菌體。

3 討 論

3.1 對攜帶NDM-5基因的大腸桿菌具有裂解作用的噬菌體的分離鑒定

大腸桿菌廣泛存在于畜禽機(jī)體以及養(yǎng)殖環(huán)境中，大腸桿菌病是畜牧養(yǎng)殖業(yè)常見疾病之一，目前對于大腸桿菌病的治療主要依賴于抗生素療法。但是由于抗生素的大量使用，大腸桿菌對抗生素產(chǎn)生了耐藥性，尤其是攜帶NDM-5基因的大腸桿菌的出現(xiàn)，可以對幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，對動物疾病治療和食品安全提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，亟需尋找一種安全、高效的方法來治療耐藥大腸桿菌引起的動物疾病[11]。

由于噬菌體能夠高效地殺死宿主菌，人們開始關(guān)注噬菌體在對抗細(xì)菌感染性疾病中的作用[12]。噬菌體在自然環(huán)境中廣泛分布，據(jù)估計(jì)，噬菌體的豐度約為 1×1031，為人類提供了一個(gè)可以利用的豐富的抗菌資源庫[13]。

本研究篩選出1株對攜帶NDM-5基因的大腸桿菌具有裂解作用的噬菌體vB_EcoM_Bp5，其能夠殺滅多株NDM-5陽性的大腸桿菌。噬菌體vB_EcoM_Bp5頭部呈現(xiàn)多面體，頭部直徑約80 nm，有一個(gè)可伸縮長尾，尾部長約90 nm，直徑約20 nm，屬于肌尾病毒科，與吳偉勝[14]報(bào)道的無明顯的尾部，直徑為50 nm的雞源大腸桿菌噬菌體Bp5和Bp6的形態(tài)明顯不同，與郭秋菊等[15]報(bào)道的幾株大腸桿菌噬菌體的形態(tài)也有差異，說明不同地區(qū)分離出來的大腸桿菌噬菌體形態(tài)不同。

噬菌體vB_EcoM_Bp5的噬菌斑呈圓形，噬菌斑透亮，無暈圈，說明該噬菌體為裂解性噬菌體，且只可以被DNase I消化，說明該噬菌體基因組為雙鏈DNA。

3.2 噬菌體的生物學(xué)特性

噬菌體vB_EcoM_Bp5在溫度30～60 ℃時(shí)穩(wěn)定，在pH 5～10時(shí)穩(wěn)定，與王禮偉等[16]報(bào)道的大腸桿菌噬菌體EcP10相比，本研究中的噬菌體pH穩(wěn)定范圍較廣，并且穩(wěn)定性較強(qiáng)，與何覓之[17]報(bào)道的Bp9B1226噬菌體相比，本研究中的噬菌體在30～60 ℃的溫度穩(wěn)定性較高。同時(shí)，噬菌體的潛伏期為5 min，裂解量為136，與李振江等[18]報(bào)道的潛伏期20 min，裂解期20 min的大腸桿菌噬菌體PD15相比，本研究中的潛伏期較短，能夠在較短時(shí)間內(nèi)釋放出裂解性噬菌體，有效快速殺滅大腸桿菌，并且其裂解量較大，明顯高于趙俊杰[19]報(bào)道的裂解量為60.5的大腸桿菌噬菌體LZZ-17。由此可見，該噬菌體的殺菌效果比較迅速和顯著，與其他噬菌體相比，可以短時(shí)間有效地降低大腸桿菌的數(shù)量。由噬菌體vB_EcoM_Bp5的殺菌效力測定結(jié)果可知，本研究中的噬菌體在不同的MOI值下，其都能有效地使大腸桿菌的OD600在較短的時(shí)間內(nèi)快速降低，說明其裂解效果明顯，同時(shí)，噬菌體vB_EcoM_Bp5的殺菌譜較廣，不僅可以殺滅NDM-5陽性的大腸桿菌，對不攜帶NDM-5基因的大腸桿菌也有裂解作用，因此該噬菌體具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

在目前細(xì)菌耐藥性普遍存在，而新型抗菌藥物研發(fā)滯后的情況下，噬菌體療法以其獨(dú)特的優(yōu)勢又重新回到了人們的視野當(dāng)中。但是噬菌體療法也有一定的局限性，噬菌體最終應(yīng)用于臨床還有待進(jìn)一步的研究。噬菌體本身對宿主的特異性高，其應(yīng)用時(shí)存在宿主譜窄的問題，因此如何擴(kuò)大其宿主譜，以及其進(jìn)入動物機(jī)體后免疫反應(yīng)如何，都有待進(jìn)一步的研究。

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