熊礦輝，王麗霞，周 紅

(浙江省醫(yī)療健康集團杭州醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 杭州 310022)

生殖道人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染誘發(fā)女性宮頸癌是目前普遍認可的主要因素[1]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，僅為HPV感染不足以導(dǎo)致發(fā)生宮頸癌，而在受到高危型HPV感染且發(fā)生HPV病毒與宿主基因組發(fā)生整合狀態(tài)時，宮頸上皮細胞會發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，從而可能導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。在宿主不同的DNA開放讀碼框架處，HPV均可以在此與宿主基因組發(fā)生整合[2-3]。其中，不穩(wěn)定的E2基因鉸鏈區(qū)是高危HPV整合宿主基因組最常見的缺失或斷裂部位[4]。在高危HPV病毒類型中，最常見的就是人類乳頭瘤病毒16型(human papillomavirus type 16，HPV-16)[5-6]，本次研究中，采用重疊定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)探討各宮頸病變組織中HPV-16 E2基因的缺失從而判斷HPV-16與宿主基因組的整合情況，并初步探討HPV-16整合狀態(tài)及其與誘發(fā)宮頸癌之間的關(guān)系和臨床意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本

選取2012年2月至2014年12月在浙江省醫(yī)療健康集團杭州醫(yī)院活檢，宮頸錐切術(shù)及廣泛性全子宮切除術(shù)后獲得的宮頸病變組織存檔蠟塊標本252例為研究組，并根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)女性生殖道腫瘤組織學(xué)分型標準，將標本分別劃分為48例宮頸癌及204例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變組織(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)，其中包括CIN Ⅰ125例,CIN Ⅱ46例，CIN Ⅲ33例。另外將同時期因子宮肌瘤于我院行子宮全切術(shù)后提取的20例正常宮頸上皮組織作為對照組。所用標本患者均為已婚婦女且在取檢前均未行任何化療或放射治療，年齡為27～68歲，平均年齡46歲。將蠟塊標本進行常規(guī)切片和蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后顯微鏡下觀察，取細胞無異常的組織切片用于進一步實驗。所有研究對象均知情同意。

1.1.2細胞系

細胞系在37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下，將人宮頸癌細胞株SiHa、CasKi(美國生物物種保藏中心)分別于10%胎牛血清的達爾伯克氏改良伊格爾(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)培養(yǎng)液和洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)培養(yǎng)液中。

1.2方法

1.2.1石蠟切片的DNA的提取

提取石蠟切片中的DNA 對每塊蠟塊標本中進行1μm厚切片，然后每塊蠟塊各取3片進行下一步試驗。對切片進行脫蠟并分別加入30μL蛋白酶K溶液，30μL 20%SDS和500μLTES溶液，于56℃水浴72h；繼續(xù)按比例用酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)抽提2次，然后進行離心并棄去上清液后加入無水乙醇2倍體積和3mol/L的乙酸鈉1/10體積，再次離心后棄上清液并于真空泵中進行沉淀干燥，最后于沉淀中加入少量TE緩沖液進行溶解。完成DNA的提取。

1.2.2 HVP-16感染的確定

HPV-16感染的確定當在DNA水平和蛋白質(zhì)水平兩個分子水平上均檢測陽性可以判斷HPV-16感染。①DNA水平確定HPV-16感染：用PCR檢測計算機軟件輔助設(shè)計的HPV-16 E7基因以確認為HPV-16感染，設(shè)計的HPV-16 E7基因序列為：上游引物5’-AGAAACCCAGCTGTATCAT-3’，下游引物5’-TTATGGTTTCTGAGAAGAGA-3’；②蛋白質(zhì)水平確定HPV-16感染:采用免疫組化SP法檢測切片組織中HPV-16 E7的表達的蛋白質(zhì)水平從而確定HPV-16感染，具體步驟參照文獻所述[7]。

1.2.3確定HPV-16整合

HPV-16與宿主基因組織整合的確定采用重疊PCR法分別擴增確認為HPV-16感染標本的HPV-16 E2基因中的3個相互間有序列的的交叉小片段來確定是否存在病毒整合情況，A、B、C 3個交叉小片段的引物序列分別如下，見表1。

表1各片段的引物序列

Table 1 Sequence of primers in each fragment

片段上游引物序列(5'-3')下游引物序列(5'-3')A(475p)AGCACGAGGGACAGGAAAAACTTGACCCTCTACCACAGTTACTB(477p)TTGTGAAGAAGCATCAGTAACTTAAAGTATTAGCATCACCTTC(176p)GTAATAGTAACACTACACCCATAGGATGCAGTATCAAGATTTGTT

當片段A、B、C 3個不能同時陽性擴增時，提示HPV-16 E2基因存在缺失，從而代表HPV-16與宿主基因組發(fā)生了整合。HPV-16發(fā)生整合感染僅僅能擴增出C片段，而發(fā)生HPV-16的游離感染的標本能擴增出A、B、C 3個片段(以Caski和SiHa細胞株的DNA作為陽性)，見圖1。

注：M為marker;1為Caski;2為SiHa;3為CIN ;4為CIN ;5，6為Cervical Carcinoma(integrated);7為control

圖1重疊PCR擴增HPV-16 E2不同片段判斷HPV-16整合狀態(tài)

Fig. 1 Overlapping PCR amplification of different fragments of HPV-16 E2 to judge HPV-16 integration

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對文中相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗。P<0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HPV-16感染確定情況

根據(jù)PCR擴增HPV-16 E7基因結(jié)果顯示，正常宮頸上皮組織，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的組織HPV-16感染例數(shù)分別為1、30、20、18和34例，而對應(yīng)的根據(jù)免疫組化蛋白測定確定HPV-16感染結(jié)果為陽性例數(shù)分別為2、28、19、16和33例。因此正常宮頸上皮組織，CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的組織中兩者均陽性的確定HPV-16感染的例數(shù)分別為1、23、17、15和33例，且各組HPV-16感染率為5.0%(1/20)、18.4%(23/125)、36.9%(17/46)、45.5%(15/33)、68.8%(33/48)，隨著病變程度的增高感染率也增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

表2不同病變程度宮頸上皮組織的HPV-16感染率的比較

Table 2 Comparison of HPV-16 infection rates among

cervical lesions with different degrees

2.2 HPV-16與宿主基因組整合的確定

根據(jù)重疊PCR擴增HPV-16 E2基因不同片段確定HPV-16整合結(jié)果提示，在確定HPV-16感染的標本中，正常宮頸上皮組織標本的結(jié)果提示為游離感染，而CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌組織標本的整合例數(shù)分別為4、3、5和18例，整合率分別為16.7%(4/24)、18.8%(3/16)、35.7%(5/14)、58.1%(18/31)，隨著病變程度的增高整合率也增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0056)，見表3。

表3不同病變程度宮頸上皮組織的HPV-16整合率的比較

Table 3 Comparison of HPV-16 integration rates

among cervical lesions with different degrees

3討論

3.1 HPV-16感染與宮頸病變程度關(guān)系

宮頸癌是世界上婦科腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計學(xué)研究顯示世界上每年約有19萬女性死于宮頸癌，其中超過半數(shù)案例是發(fā)生在發(fā)展中國家。我國每年的宮頸癌病例約為10萬，占世界總發(fā)病人數(shù)的1/3[8]，所以宮頸癌嚴重的影響著我國女性的生命健康，對此進行的防治工作刻不容緩。

直到目前，有大量的實驗室研究以及流行病學(xué)研究結(jié)果都證明，HPV病毒感染是引起宮頸癌發(fā)生的最主要因素，并且高危型的HPV病毒持續(xù)感染是主要的病因[2,9]。在多種高危型HPV類型中，HPV-16感染是最常見的引起宮頸癌發(fā)生的主要類型。本次研究結(jié)果顯示，HPV-16感染率隨著宮頸病變程度級別的加重而呈上升趨勢；且HPV-16與宿主基因組的整合率在宮頸癌患者中高達68.8%，并且隨著宮頸病變程度的加重整合率出現(xiàn)明顯的提高，提示HPV-16感染與宮頸病變程度呈正相關(guān)，并且提示宮頸病變發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的過程中HPV-16整合狀態(tài)的存在是高危因素。

3.2 HPV-16整合感染與宮頸病變組織惡化之間的相關(guān)性以及作用機制

有研究表明，多數(shù)的HPV感染是一過性的，一般病毒會在感染后的6～12個月內(nèi)消退。但是當在宿主的防御機制發(fā)生缺陷或者基因發(fā)生突變的時候，HPV病毒的基因片段則會與宿主發(fā)生改變的細胞基因組發(fā)生相關(guān)整合，因而導(dǎo)致細胞的基因調(diào)控機制出現(xiàn)失調(diào)的情況[10]。若HPV病毒的繁殖停止在復(fù)制周期的某一時相，就會發(fā)生HPV的持續(xù)感染，HPV特別是高危型HPV的持續(xù)性及反復(fù)性感染可能會導(dǎo)致宮頸細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。有研究認為宮頸組織發(fā)生癌變的過程中的早期事件有可能就是HPV與宿主基因組發(fā)生整合[11-12]，但是關(guān)于其整合的具體的發(fā)生時相目前尚未有統(tǒng)一的結(jié)論，還需要進一步的研究討論。目前有研究表示在宿主宮頸病變組織中，HPV并非只是以單純的整合感染的狀態(tài)存在，因此HPV-16整合感染與宮頸病變組織惡化之間的相關(guān)性以及作用機制還需要進一步的研究。但是HPV-16作為惡化的高危因素，在預(yù)測宮頸癌前病變的轉(zhuǎn)歸上存在著一定預(yù)測作用。

3.3 HPV-16能夠提高宮頸癌初步篩選特異度

HPV DNA檢測方法是目前我國最普遍的宮頸癌初步篩選方法[3]，但不能發(fā)現(xiàn)HPV病毒基因是否與宿主基因組發(fā)生了整合感染[13]。在本次研究中，在CIN發(fā)生HPV-16感染的病例中就有22.3%發(fā)生HPV-16整合，即使在CINⅠ中整合率就有16.7%，說明高危HPV整合在宮頸病變的發(fā)生的早期中就有整合并且貫穿整個癌變過程。因此采用簡單、快速的HPV DNA檢測和高危HPV整合狀態(tài)的檢測，能夠提高宮頸癌初步篩選特異度。

綜上所述， HPV-16的整合感染可能導(dǎo)致宮頸病變惡化，在HPV DNA檢測的基礎(chǔ)上聯(lián)合對高危HPV整合感染狀態(tài)進行檢測有利于提高宮頸癌篩查特異度并在早期預(yù)測宮頸病變的轉(zhuǎn)歸。

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