郭智俊，彭桂香

(廣東省人民醫(yī)院南海醫(yī)院/佛山市南海第二人民醫(yī)院病理科，廣東佛山 528251)

泌尿系腫瘤是我國常見的惡性腫瘤之一，尿脫落細(xì)胞檢查對泌尿系腫瘤的早期診斷、術(shù)后隨訪的意義已得到公認(rèn)。常規(guī)的尿脫落細(xì)胞檢查采用涂片法，該方法無創(chuàng)、快速、操作簡易，在臨床工作中得到了廣泛應(yīng)用。但常規(guī)涂片法細(xì)胞少而分散，細(xì)胞核易退變成毛玻璃狀；當(dāng)標(biāo)本含有大量血液時，涂片見成片的紅細(xì)胞，常常出現(xiàn)細(xì)胞堆積、重疊、厚薄不均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及背景不清晰，細(xì)胞從玻片脫落等現(xiàn)象，往往導(dǎo)致癌細(xì)胞檢出率低。近年來，切片技術(shù)在胸腔積液、腹水和痰脫落細(xì)胞學(xué)中的應(yīng)用，提高了制片質(zhì)量，但未見尿脫落細(xì)胞切片的研究報道。筆者在實際工作中經(jīng)過研究探索，設(shè)計了尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法，克服了常規(guī)尿脫落細(xì)胞涂片法的缺點，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器 采用普通水平式離心機，石蠟切片采用病理科的常規(guī)組織切片程序。

1.1.2試劑配制 (1)5%瓊脂：稱取瓊脂粉5 g置三角燒杯中，加蒸餾水100 mL加熱煮沸使瓊脂充分溶解，置65 ℃恒溫箱中，保持熔化狀態(tài)備用。(2)0.3%伊紅乙醇溶液：0.3 g伊紅加入95%乙醇溶液至100 mL。(3)10%醋酸乙醇溶液：10 mL冰醋酸加入95%乙醇溶液至100 mL。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本留取 為患者備好一個容量為500 mL 以上的潔凈尿瓶，加入10%醋酸乙醇溶液100 mL，并在其100 mL處作一標(biāo)記，備用。將晨起第2次尿液排入上述備用的尿瓶內(nèi)，或者囑患者在排空膀胱后，飲水500 mL左右，于1～2 h后收集第1次膀胱排空的尿液200～300 mL于上述備用的尿瓶中送病理科檢查。

1.2.2標(biāo)本處理 將收到的尿液標(biāo)本靜止沉淀30 min，慢慢倒掉尿液至100 mL標(biāo)記處，并將此尿液分裝在兩個50 mL的離心管中，或者將尿液分裝在8個15 mL的離心管中，經(jīng)1 800 r/min離心沉淀5 min，棄上清液；然后將沉淀物集中到一支試管內(nèi)，經(jīng)1 800 r/min離心沉淀5 min，棄上清液，取少量沉淀物做直接涂片2張，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色；再在剩余的沉淀物中加入0.3%伊紅乙醇溶液1～2 mL，以2 000 r/min離心8 min，吸去上清液，將保留管底沉淀物的試管置65 ℃恒溫箱中備用。

1.2.3沉淀物瓊脂石蠟雙包埋處理 將5%瓊脂從65 ℃恒溫箱中取出。同時從恒溫箱中取出保留管底沉淀物的試管，加入熔化的瓊脂1～3滴，放置冰箱待冷凝固成細(xì)胞團(tuán)塊后取出細(xì)胞團(tuán)塊，用刀片將其周圍的瓊脂切去。將細(xì)胞團(tuán)塊放入已編號的包埋盒中，置脫水機常規(guī)脫水、透明、浸蠟，取出細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行石蠟包埋?；蛘邔⒓?xì)胞團(tuán)塊放入已編號的包埋盒中進(jìn)行人工脫水，步驟：(1)乙醇甲醛混合液(95%乙醇9份，濃甲醛1份)中30 min；(2)95%乙醇Ⅰ20 min；(3)95%乙醇Ⅱ30 min；(4)100%乙醇Ⅰ20 min；(5)100%乙醇Ⅱ30 min；(6)叔丁醇Ⅰ20 min；(7)叔丁醇Ⅱ30 min；(8)石蠟(熔點52 ℃)Ⅰ30 min；(9)石蠟(熔點58～60 ℃)Ⅱ30 min。以上各步驟均放置在62 ℃的恒溫箱中進(jìn)行。取出細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行石蠟包埋。

1.2.4連續(xù)切片和染色 蠟塊修整齊，越小越好，連續(xù)切片，沉淀物少的標(biāo)本一次切完，不換刀，不移動刀片。切片應(yīng)薄而均勻，切片厚度為3～4 μm，貼片時水溫要恰當(dāng)，使蠟片伸展無皺折，將切片分別貼在普通載玻片和涂膠載玻片上，每張載玻片根據(jù)切片的大小按順序排列3～6排，其中第1～3片貼在普通載玻片上，第4～6片貼在涂膠載玻片上，按順序以此類推。普通載玻片按常規(guī)方法脫蠟、HE染色、封片；涂膠載玻片留做備用。

2 結(jié) 果

包埋好的蠟塊經(jīng)過切片、HE染色后，鏡下細(xì)胞量明顯比常規(guī)涂片法豐富，細(xì)胞集中，厚薄均勻，結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)對比好，色彩鮮艷明亮，部分可見組織結(jié)構(gòu)，易于觀察診斷，見表1、圖1、2。

圖1 尿脫落細(xì)胞涂片法鏡檢(HE×200)

質(zhì)量指標(biāo)/方法涂片法切片法細(xì)胞數(shù)量較少較多鏡下觀察范圍觀察范圍大,費時觀察范圍小,省時細(xì)胞變形及退變 常見偶見

續(xù)表1 兩種方法制片質(zhì)量比較

圖2 尿脫落細(xì)胞切片法鏡檢(HE×200)

3 討 論

尿路上皮分布廣泛，從腎盂、腎盞、輸尿管、膀胱直到尿道起始部。尿路上皮細(xì)胞癌是繼前列腺/乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌后第4種最常見的腫瘤類型[1]。尿路上皮細(xì)胞癌中膀胱癌最常見，占所有尿路上皮細(xì)胞癌的90%～95%[2]。膀胱癌的發(fā)病率和病死率在泌尿系統(tǒng)疾病中均居首位[3]。雖然其惡性程度低，但復(fù)發(fā)率較高[4]，一旦發(fā)生侵襲或轉(zhuǎn)移預(yù)后極差[5]。因此，早期發(fā)現(xiàn)并給予積極治療是提高臨床治愈率的關(guān)鍵[6-8]。目前膀胱癌的診斷主要以膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞學(xué)和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)為主，然而三者都存在一定缺陷[9-10]，膀胱鏡檢查是目前術(shù)前診斷和術(shù)后隨訪的“金標(biāo)準(zhǔn)”，膀胱鏡雖然在檢查過程中能夠很好地直觀病灶及取樣活檢，但是膀胱鏡是有創(chuàng)檢查，患者往往很抵觸這種昂貴、痛苦的侵入性檢查，在臨床應(yīng)用中受到了很大的制約；同時，膀胱鏡由于觀察范圍有限并依賴操作者的經(jīng)驗，可能會遺漏位于膀胱前壁和腎小盞等難以窺視部位的腫瘤，另外一些平坦型病變或原位癌也是膀胱鏡檢查的盲區(qū)[11]。FISH診斷膀胱癌的特異性與常規(guī)尿脫落細(xì)胞相當(dāng)，且敏感性大大提高，優(yōu)于尿脫落細(xì)胞檢查，有研究表明該檢測有著較高的靈敏度(70%～96%)及特異度(65%～96%)[12-14]。但是，F(xiàn)ISH檢測費用昂貴，在一定程度上增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時其所需設(shè)備及技術(shù)要求高、操作流程復(fù)雜，大范圍普及有一定的難度。超聲、X射線、CT和磁共振成像(MRI)影像學(xué)檢查，雖然整個尿路的情況能夠顯示出來，但對于血尿患者中常見的占位性病變?nèi)缪龎K、炎性包塊和腫瘤不易鑒別，常常不能明確病灶的性質(zhì)。

尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查是臨床泌尿系腫瘤的有效篩查手段[15-16]。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測膀胱癌的靈敏度為13%～75%，特異度為85%～100%，其特異度不但是目前無創(chuàng)診斷指標(biāo)中最高的，而且也得到了美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南作為無創(chuàng)診斷指標(biāo)的惟一推薦。其在原位癌的診斷中具有較高價值[17]。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查不受腫瘤部位的限制，即使在發(fā)病早期由于腫瘤細(xì)胞代謝旺盛仍可有較多的癌細(xì)胞從病灶表面脫落，可以通過細(xì)胞學(xué)的方法早期發(fā)現(xiàn)及診斷。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法簡便，可反復(fù)多次檢查，且可以發(fā)現(xiàn)膀胱鏡檢查不易觀察到的特殊部位腫瘤，對患者無損傷，安全、經(jīng)濟(jì)、特異性較高，容易被患者接受，因此在基層醫(yī)院廣泛應(yīng)用。但尿脫落細(xì)胞涂片檢查的缺點是靈敏度低[18]。尿脫落細(xì)胞涂片檢查靈敏度低的原因是：(1)傳統(tǒng)的留尿方法是每天留取早晨第2次尿的中段尿10 mL，由于只留取10 mL中段尿，常常導(dǎo)致離心后無沉淀物，涂片鏡下細(xì)胞成分少或看不到細(xì)胞成分，從而影響尿脫落細(xì)胞檢出率；此外，在送病理科之前未對尿液標(biāo)本進(jìn)行處理，細(xì)胞成分易被變性。(2)常規(guī)尿液涂片法涂片范圍大，鏡下細(xì)胞分散、觀察費時，易漏診。(3)涂片細(xì)胞固定較困難，如果用濕固定法，直接將玻片放入95%乙醇內(nèi)固定，會造成大多數(shù)細(xì)胞脫落，造成漏診，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性；如果干燥后再固定，細(xì)胞會發(fā)生退變，細(xì)胞核模糊不清，造成誤診，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。(4)當(dāng)尿液中有較多細(xì)胞時，特別是血尿患者有大量紅細(xì)胞時，常規(guī)涂片鏡下細(xì)胞出現(xiàn)堆積重疊現(xiàn)象，造成診斷困難。為了克服涂片法的不足，筆者設(shè)計了尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法，該方法收集晨起的第2次全部尿液，收集尿液更多，陽性率更高。同時，由于在留取尿液標(biāo)本中加入了10%醋酸乙醇溶液，細(xì)胞在液體中立即固定，避免常規(guī)涂片后空氣干燥造成的細(xì)胞退變，保持了原有的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；其中的醋酸也能溶解過多的紅細(xì)胞，既避免紅細(xì)胞遮擋、細(xì)胞重疊，又節(jié)省了閱片時間，減少了漏診，提高了工作效率。標(biāo)本離心處理過程中加入0.3%伊紅乙醇溶液，使沉淀物著色，便于在包埋、切片和漂片時辨認(rèn)。瓊脂是一種從海藻類石花菜中提取的多分支的復(fù)雜多糖，具有三維空間網(wǎng)狀多孔性結(jié)構(gòu)，瓊脂溶解度為90 ℃，凝固度為40 ℃。同時，瓊脂易溶于水，在室溫下幾分鐘就能凝固。瓊脂具有凝固性、穩(wěn)定性、支持性和耐切割性，在浸蠟的溫度下仍為固態(tài)。由于固態(tài)瓊脂含有網(wǎng)狀孔隙，所以在脫水、透明、浸蠟的過程中乙醇、二甲苯或叔丁醇和石蠟都可通過瓊脂滲透到組織細(xì)胞中，不影響組織細(xì)胞的脫水、透明和浸蠟。瓊脂的濃度不能太高，低濃度的瓊脂更有利于脫水劑、透明劑和石蠟的滲透；但濃度也不可太低，以保持其形狀完整，不易碎裂為宜。本文使用5%瓊脂達(dá)到了良好的效果。尿脫落細(xì)胞用瓊脂包埋后，在脫水、透明、浸蠟的過程中既可以避免細(xì)胞及碎小組織丟失及其他細(xì)胞、碎小組織的混入，又可克服尿脫落細(xì)胞沉淀物太小所造成的包埋困難。用該方法幾乎能收集尿液中的所有細(xì)胞，制成的蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，各細(xì)胞及碎小組織可以完整切出，防止由于切片不完全所造成的漏診。同時，筆者采取的貼片方法有利于切片連續(xù)不亂，整齊排列，每張載玻片可多貼切片，既節(jié)省載玻片又有利于顯微鏡下觀察。制出的切片鏡下細(xì)胞量明顯比常規(guī)離心涂片法豐富，切片觀察范圍比涂片小，觀察省時，細(xì)胞無重疊，厚薄一致，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及背景清晰，部分可見組織結(jié)構(gòu)；HE染色核質(zhì)對比好，色彩鮮艷明亮，可提高尿脫落陽性細(xì)胞的檢出率。同時，蠟塊便于長期保存及進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)等檢測。

綜上所述，尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法克服了常規(guī)涂片法的不足，設(shè)備簡單，操作簡便，費用低廉，在尿路上皮癌的診斷和術(shù)后監(jiān)測上具有重要的臨床意義,值得普及推廣應(yīng)用，尤其是可以作為基層醫(yī)院的常規(guī)篩查方法。同時，筆者目前正在研究應(yīng)用尿脫落細(xì)胞涂片法和尿脫落細(xì)胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法進(jìn)行對比觀察并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)等檢測，進(jìn)一步尋找早期診斷膀胱癌的特異度和靈敏度更高的診斷指標(biāo)，從而降低假陽性率和假陰性率。

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