徐建飛，劉占峰，盧偉京，雷 雯，侯 捷，杜曉寧

(上?；ぱ芯吭河邢薰?國家同位素工程技術(shù)研究中心 上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062)

原兒茶酸是白色至微棕色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)約200 ℃(分解)，溶于熱水、乙醇和乙醚，微溶于冷水，不溶于苯[1]。在沸水中分解，并放出二氧化碳。水溶液遇三氯化鐵呈綠色，遇碳酸氫鈉呈暗紅色[2]。原兒茶酸具有抗菌作用，體外試驗(yàn)時(shí)對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、產(chǎn)堿桿菌及枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用，亦有祛痰、平喘作用，臨床用于治療慢性氣管炎[3-4]。原兒茶酸廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等行業(yè)，是重要的醫(yī)藥化工中間體，近年來國內(nèi)外的化工需求量逐漸增加[5-6]。

同位素標(biāo)記原兒茶酸是醫(yī)藥和化工領(lǐng)域重要示蹤劑。同位素示蹤技術(shù)是從體外加入與生物體內(nèi)的元素或物質(zhì)完全共同運(yùn)行的示蹤物，用以追蹤生物體內(nèi)某元素或某物質(zhì)的運(yùn)行或變化的一種方法[7]。利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，對(duì)藥物進(jìn)行同位素標(biāo)記，通過同位素藥物和代謝物檢測(cè)，對(duì)其藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥代學(xué)和臨床研究提供精準(zhǔn)示蹤，為新藥研發(fā)提供可靠數(shù)據(jù)，同時(shí)提高我國藥物研發(fā)實(shí)力，促進(jìn)人類疾病治療和健康發(fā)展[8-9]?！熬珳?zhǔn)醫(yī)療”為未來醫(yī)藥學(xué)指明了方向，不僅是一種定制醫(yī)療模式，還將對(duì)當(dāng)代醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生全方位的影響，例如個(gè)性化用藥、精準(zhǔn)藥物設(shè)計(jì)、健康數(shù)據(jù)獲取等。目前，穩(wěn)定性同位素標(biāo)記示蹤劑已廣泛應(yīng)用于人類健康的精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域[10-11]，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床研究、多種疾病的診斷與鑒別、病情判斷、治療效果評(píng)價(jià)、臟器功能研究和新藥開發(fā)等方面取得了成功，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

文獻(xiàn)報(bào)道的原兒茶酸合成方法有：(1) 香蘭素經(jīng)堿熔溶氧化脫甲基，再經(jīng)酸化制備，該工藝需要240 ℃以上高溫，反應(yīng)大部分時(shí)間為固相反應(yīng)，難以控制，必須使用特殊的反應(yīng)設(shè)備，投資大、設(shè)備利用率低，特別是難以進(jìn)行同位素標(biāo)記產(chǎn)品的制備[12]；(2) 采用胡椒醛作原料，先用高錳酸鉀氧化制成胡椒酸，再經(jīng)三氯化鋁水解制備原兒茶酸[13]，此法收率較高，但同樣難以引入同位素標(biāo)記。參考以上路線，設(shè)計(jì)了合成路線，可為醫(yī)藥和化工領(lǐng)域研究提供重要的示蹤劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

7890B-7000C氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司，配有EI離子源及Qualitative Analysis B.06.00色譜工作站；LC-MS 2020液質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及LabSolutions系統(tǒng)工作站；Magna-IR-550型紅外光譜儀：美國Nicolet產(chǎn)品，KBr壓片制樣；Bruker AV 400 MHz核磁共振：德國Bruker產(chǎn)品，配有超屏蔽超導(dǎo)磁體系統(tǒng)。

1.2 主要材料與試劑

13C標(biāo)記13CO2：99.0%13C，美國CIL公司產(chǎn)品；3,4-二甲氧基溴苯：分析純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；原兒茶酸：標(biāo)準(zhǔn)品，美國AccuStandard公司產(chǎn)品；其余均為市售的國產(chǎn)分析純?cè)噭?，溶劑做無水處理。

1.3 合成方法

原兒茶酸-(13COOH)合成路線示于圖1。稱取3.1 g鎂條和30 mL 2-甲基四氫呋喃混合，在N2保護(hù)下，同時(shí)滴加14.1 g的3,4-二甲氧基溴苯的2-甲基四氫呋喃溶液和12.1 g 1,2-二溴乙烷溶液，80 ℃下加熱回流。升溫時(shí)引發(fā)反應(yīng)，30 min后反應(yīng)液開始劇烈反應(yīng)，回流4 h后，反應(yīng)液呈微渾濁狀，鎂條反應(yīng)完全。

將反應(yīng)液冷卻至-10 ℃，通入5 L13C標(biāo)記13CO2氣體，低溫下攪拌反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后用1 mol/L H2SO4水解。用100 mL無水乙醚萃取，飽和NaCl洗，無水Na2SO4干燥過夜。旋去溶劑，得7.70 g淡黃色中間體3,4-二甲氧基苯甲酸-(13COOH)，收率65.1%。ESI-MSm/z:181[M-H]-；1H NMR (CD3OD，400 MHz)，δ：3.83(d，6 H，J= 7.8 Hz ，CH3)，6.82 (d，1 H，J= 8.4 Hz，H-5)，7.44 (dd，1 H，J= 8.4，1.6 Hz，H-6)，7.45(d，1 H，J= 1.6 Hz，H-2)；13C NMR(CD3OD)，δ：56.83，115.3,0，116.61，121.74，122.24，144.81，150.01。

圖1 原兒茶酸-(13COOH)合成路線Fig.1 Synthesis of protocatechuic acid-(13COOH)

將100 mL BBr3的二氯甲烷溶液冷卻至-20 ℃，加入7.70 g 3,4-二甲氧基苯甲酸-(13COOH)，保持低溫，攪拌過夜。反應(yīng)加入少量水進(jìn)行淬滅，過濾，濾液用無水乙醚萃取3次，飽和NaCl洗，無水Na2SO4干燥過夜。旋去溶劑，得褐色粗品6.15 g。

將粗品直接用熱水溶解(70～80 ℃)，活性炭脫色1 h，過濾后旋去大部分水，冷卻后放置于冰箱過夜析出無色固體，真空干燥后得到4.60 g原兒茶酸-(13COOH)，收率70.1%。熔點(diǎn)200～200.8 ℃[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 引發(fā)劑對(duì)3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響

格利雅反應(yīng)常用的引發(fā)劑可以是碘甲烷、單質(zhì)碘和1,2-二溴乙烷。在N2保護(hù)下，使用四氫呋喃(THF)作溶劑，考察不同引發(fā)劑對(duì)中間體3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響，結(jié)果列于表1。

表1 不同引發(fā)劑對(duì)3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響Table 1 Effect of different initiators on the yield of 3,4- dimethoxy benzoic acid

由表1 可以看出，單質(zhì)碘未引發(fā)反應(yīng)，造成反應(yīng)失?。坏饧淄橐l(fā)反應(yīng)較為困難，造成3,4-二甲氧基苯甲酸的收率偏低；1,2-二溴乙烷作為引發(fā)劑時(shí)可以有較好收率。原因在于1,2-二溴乙烷和金屬鎂表面的氧化物反應(yīng)生成溴化鎂和乙烯，鎂表面的氧化膜消耗完以后，新鮮的鎂暴露出來，和原料3,4-二甲氧基溴苯反應(yīng)生成格式試劑。所以在合成中間體3,4-二甲氧基苯甲酸中選擇1,2-二溴乙烷為引發(fā)劑。

2.2 溶劑對(duì)3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響

不同溶劑對(duì)3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響列于表2。在格式反應(yīng)中，一般使用絕對(duì)乙醚、無水四氫呋喃和無水甲基四氫呋喃三種溶劑，三種溶劑均使用鈉絲回流至二苯甲酮顯紫色。以3,4-二甲氧基溴苯為原料制備目標(biāo)產(chǎn)物3,4-二甲氧基苯甲酸為研究對(duì)象，討論不同溶劑對(duì)反應(yīng)收率的影響。

表2 不同溶劑對(duì)3,4-二甲氧基苯甲酸收率的影響Table 2 Effect of different solvents on the yield of 3,4-dimethoxy benzoic acid

注：反應(yīng)時(shí)均以回流溫度反應(yīng)。

格利雅反應(yīng)通常選用絕對(duì)乙醚作溶劑。這是由于乙醚分子中的氧原子具有孤對(duì)電子，可以和格氏試劑形成可溶于溶劑的配合物。但是在此反應(yīng)中，反應(yīng)生成物因在溶劑中溶解度差而覆蓋在金屬鎂表面，從而使格利雅反應(yīng)終止。除了絕對(duì)乙醚外，四氫呋喃也是進(jìn)行格利雅反應(yīng)的良好溶劑，可以順利地發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)使用2-甲基四氫呋喃做溶劑時(shí)，也可以順利發(fā)生反應(yīng)，并且反應(yīng)收率最高。原因在于2-甲基四氫呋喃的沸點(diǎn)(80 ℃)比四氫呋喃的沸點(diǎn)(66 ℃)高，提高反應(yīng)溫度可以更容易引發(fā)反應(yīng)，因此提高了反應(yīng)速度；另外格氏試劑在甲基四氫呋喃中的溶解度也較大，而2-甲基四氫呋喃在水中的溶解度比四氫呋喃低，因此可以更容易地將反應(yīng)產(chǎn)物獨(dú)立地包含在其中。經(jīng)三種常用溶劑比較，2-甲基四氫呋喃優(yōu)于另外兩種溶劑。

2.3 脫甲基反應(yīng)

3,4-二甲氧基苯甲酸脫甲基方法較多，嘗試了如下三種方法。

(1) AlCl3法。二氯甲烷作溶劑，室溫反應(yīng)后能脫除甲基，但是不完全，收率偏低。

(2) HBr法。加入5～10倍量市售48%HBr進(jìn)行回流反應(yīng)，但是原兒茶酸在高溫中會(huì)分解，造成收率偏低。

(3) BBr3法[15]。二氯甲烷作溶劑，-20 ℃下攪拌過夜，完全脫除甲基，并且避免了因?yàn)闇囟雀叨巩a(chǎn)品分解，操作簡單，收率高，其反應(yīng)機(jī)理示于圖2。經(jīng)比較，BBr3法是3,4-二甲氧基苯甲酸脫甲氧基較優(yōu)方法。

圖2 BBr3脫甲基反應(yīng)機(jī)理Fig.2 Mechanism of demethylation using BBr3

2.4 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

2.4.1HPLC 以市售原兒茶酸標(biāo)樣為外標(biāo)試劑，通過HPLC的測(cè)試分析，證明本實(shí)驗(yàn)合成產(chǎn)物原兒茶酸-(13COOH)與標(biāo)樣保留時(shí)間一致，外標(biāo)法[16]定量分析其純度為99.1%，結(jié)果示于圖3。

2.4.2MS 取配制好的原兒茶酸-(13COOH)甲醇溶液進(jìn)行LC-MS聯(lián)用負(fù)離子模式分析，電噴霧離子源測(cè)定結(jié)果示于圖4。

由圖4可知，m/z154為[M-H]-峰。天然豐度產(chǎn)物分子離子峰為m/z154，經(jīng)13C標(biāo)記后分子離子峰為m/z155，在ESI負(fù)離子模式下減氫離子的分子離子峰為m/z154，可以確認(rèn)樣品相對(duì)分子質(zhì)量為m/z155，同理論值。m/z154與m/z153峰強(qiáng)度比較，經(jīng)質(zhì)量簇計(jì)算方法[17]計(jì)算13C同位素豐度98.9%。

2.4.31H NMR 原兒茶酸-(13COOH)：1H NMR (CDCl3，400 MHz)，δ：7.08(d，1 H，J=8.4 Hz，H-5)，7.35(dd，1 H，J=8.4, 1.6 Hz，H-6)，7.48(d，1 H，J=1.6 Hz，H-2)。δH7.08處峰為苯環(huán)上5位的氫，峰面積為1，δH7.35處峰為苯環(huán)上1位的氫，峰面積為1，δH7.48處峰為苯環(huán)上的6位的氫，峰面積為1。羧基和羥基由于在氘代溶劑中易被氘代，故無特征峰，結(jié)果示于圖5。各峰歸屬均符合理論值。

a——原兒茶酸;b——原兒茶酸-(13COOH)圖3 原兒茶酸的HPLC圖a——ST of protocatechuic acid; b——Protocatechuic acid-(13COOH)Fig.3 HPLC of protocatechuic acid

圖4 原兒茶酸-(13COOH)ESI質(zhì)譜圖Fig.4 ESI MS of protocatechuic acid-(13COOH)

圖5 原兒茶酸-(13COOH)1H NMRFig.5 1H NMR of protocatechuic acid-(13COOH)

3 結(jié)論

以3,4-二甲氧基溴苯為原料經(jīng)三步反應(yīng)合成原兒茶酸-(13COOH)，并用HPLC、MS、1H NMR 和13C NMR對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行表征，確定了其結(jié)構(gòu)、純度和同位素豐度。該方法制備原兒茶酸-(13COOH)路線簡潔、高效，得到的化合物作為重要示蹤劑為醫(yī)藥和化工領(lǐng)域研究提供了基礎(chǔ)。

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