侯 捷，張鵬帥，侯靜華，雷 雯，杜曉寧

(上?；ぱ芯吭河邢薰?國家同位素工程技術研究中心上海分中心上海穩(wěn)定性同位素工程技術研究中心，上海 200062)

茶葉中富含多種氨基酸，是構成茶葉品質(zhì)和滋味的重要成分，對茶葉香氣的形成有著重要的作用[1]。氨基酸在茶葉加工過程中參與茶葉香氣的形成，由氨基酸所轉(zhuǎn)化成的醇類等揮發(fā)性物質(zhì)都是茶葉的香味物質(zhì)。如茶氨酸可以緩解茶葉的苦澀味增強其甜味，是茶葉品質(zhì)評價的重要因子之一[2-5]，絲氨酸、丙氨酸的甜味，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺具有的鮮甜帶酸滋味特性共同影響了茶葉的品質(zhì)和滋味[6-8]。對茶葉中具有呈味特性的氨基酸(茶氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸)進行含量測定，可以評價茶葉的品質(zhì)級別[9]。隨著代謝組學的發(fā)展，通過穩(wěn)定同位素示蹤技術可以追蹤目標化合物的合成與代謝過程，進而有效地對目標氨基酸的生成過程進行調(diào)控。如利用13CO2研究茶樹呼吸作用對茶葉品質(zhì)的影響；通過對茶樹施加15N標記硝態(tài)氮、15N標記銨態(tài)氮等氮肥，檢測茶樹體對肥料的轉(zhuǎn)化利用情況，通過氨基酸在茶樹體內(nèi)的代謝積累，進而研究茶樹對土壤中不同氮素肥料的利用水平[10-11]?，F(xiàn)有文獻大多是對不同基質(zhì)中的氨基酸含量進行分析[12-18]，而關于樣品中15N標記氨基酸同位素豐度的檢測方法的報道較少[19]。本文以茶葉中15N富集氨基酸的同位素豐度檢測為例，在優(yōu)化的衍生化條件下建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定植物中15N富集氨基酸同位素豐度的檢測方法，在10%～98%的15N同位素豐度范圍內(nèi)對方法進行驗證，并對茶葉中六種目標氨基酸的同位素豐度進行測定。

1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC-MS/MS，7890B-7000C，美國Agilent公司；HP-5 MS毛細管柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司；電子天平：精度0.01 mg，美國OHAUS；真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；超聲機：上海一恒科學儀器有限公司；渦旋震蕩機：上海安譜科技有限公司；氮吹儀：上海安譜科技有限公司；低溫高速離心機：韓國Heraeus公司；超純水系統(tǒng)：美國Merck Millipore 公司。

衍生化試劑N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)：美國Regis Technologies公司；天然豐度氨基酸標準品：茶氨酸(純度98.5%)、丙氨酸(純度99.0%)、天門冬酰胺(純度98.5%)、谷氨酸(純度99.2%)、谷氨酰胺(純度98.5%)、絲氨酸(純度99.0%)：購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；穩(wěn)定同位素15N標記高豐度氨基酸對照品：丙氨酸-15N(純度98.5%，豐度98.5%)、天門冬酰胺-15N2(純度98.2%，豐度98.1%)、谷氨酸-15N(純度98.8%，豐度98.2%)、谷氨酰胺-15N2(純度98.6%，豐度98.8%)、絲氨酸-15N(純度98.1%，豐度95.5%)：上?；ぱ芯吭河邢薰痉€(wěn)定性同位素工程技術研究中心研制，同位素豐度由氣體同位素質(zhì)譜儀(Finnigan MAT-271)測定；綠茶樣品：中科院茶葉研究所(杭州)提供；乙腈(色譜級)：西班牙Scharlab公司；甲苯(分析純)、吡啶(分析純)：上海凌峰化學試劑有限公司。

2 實驗方法

2.1 氨基酸對照品的配制

天然豐度氨基酸對照品：稱取谷氨酸10.3 mg，谷氨酰胺10.3 mg，天冬酰胺9.7 mg，丙氨酸10.2 mg，絲氨酸9.0 mg，茶氨酸9.1 mg，每種氨基酸均溶于水并定容至10 mL容量瓶中，作為天然豐度氨基酸對照品待用，除15N標記的茶氨酸外，其余5種15N標記的氨基酸稱取相同的質(zhì)量，均溶于水并定容至10 mL容量瓶中，作為15N標記高豐度氨基酸對照品待用。將天然豐度氨基酸對照品與15N標記高豐度氨基酸對照品按照9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、2∶8的比例制成不同豐度的氨基酸對照品。取上述對照品及純15N標記高豐度氨基酸溶液各50 μL于氣相瓶中，氮吹干，依次加入200 μL吡啶和200 μL MSTFA，80 ℃下反應60 min，待GC-MS分析。

2.2 茶葉樣品的處理

稱取粉碎后的茶葉樣品0.251 1 g，加入5 mL煮沸的蒸餾水，水浴加熱10 min，待冷卻后，轉(zhuǎn)入25 mL離心管中，以10 000 r/min的速率離心15 min，上清液氮吹干后，40 ℃真空干燥2 h，依次加入500 μL吡啶和500 μL MSTFA，80 ℃下反應60 min，待GC-MS分析。

2.3 實驗條件

2.3.1色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(純度99.999%)，流速1.0 mL/min；進樣口溫度290 ℃；升溫程序：以5 ℃/min由80 ℃升至110 ℃，然后以10 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至170 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，最后以20 ℃/min升至300 ℃；進樣量1 μL；分流比10∶1。

2.3.2質(zhì)譜分析條件 電子轟擊離子源(EI)，電離能量70 eV；全掃描(Scan)模式，掃描范圍m/z50～500；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度300 ℃。

3 結果與討論

3.1 氨基酸衍生化方法優(yōu)化

3.1.1衍生化試劑 有報道以MSTBFA[20]或MDBSTFA[21]為衍生化試劑，研究了大腸桿菌、酵母等微生物中或菌體內(nèi)13C標記氨基酸同位素豐度。對比了BFTFA(N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺)和MSTFA(N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺)對目標氨基酸的衍生化效果。在硅烷化反應進程中，三甲基硅烷(TMS)將取代氨基酸中含有活性氫的基團(羧基上的H和氨基上的H)，如圖1所示。與BSFTA相比，MSTFA對目標氨基酸的衍生化效率更高。

圖1 丙氨酸與MSTFA的反應Fig.1 Derivatization reaction of alanine with MSTFA

輔助有機溶劑對衍生化效果也有一定影響，輔助溶劑是待測物中某些物質(zhì)的配體，會影響衍生化反應的速率。比較乙腈、吡啶、甲苯作為輔助溶劑對目標氨基酸衍生化效果的影響，結果示于圖2。從單種氨基酸分別以乙腈、吡啶、甲苯作為輔助衍生化試劑的比較可見，甲苯和吡啶作為溶劑的衍生化效果較好，然而吡啶對于天冬酰胺的衍生化效率很低，綜合考慮，選用甲苯作為輔助衍生試劑。

圖2 輔助溶劑對目標氨基酸衍生化效率的影響Fig.2 Effect of solvent on derivatization

3.1.2衍生化溫度及時間 衍生化的溫度及時間也是影響衍生化效率的因素。以甲苯作為輔助溶劑，對比了茶氨酸在60、70、80、90 ℃分別衍生20、40、60 min時的效果，隨著溫度升高、衍生化時間的增加，茶氨酸的衍生化效率提高，結果示于圖3。綜合考慮，確定衍生化溫度為80 ℃，衍生時間為60 min。

3.2 氨基酸對照品的檢測

3.2.1天然豐度氨基酸與15N標記氨基酸的GC-MS圖譜分析 將衍生化的氨基酸對照品進行GC-MS分析，改變氣相色譜的升溫程序，茶氨酸和谷氨酰胺始終沒有達到基線分離，本文主要對氨基酸的同位素豐度進行分析，茶氨酸和谷氨酰胺沒有基線分離并不會對同位素豐度計算產(chǎn)生影響。將氨基酸衍生物的離子碎片信息在NIST譜庫中進行匹配，6種天然豐度氨基酸衍生物的出峰順序為：丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、茶氨酸、谷氨酰胺。天然豐度氨基酸對照品和15N標記氨基酸對照品衍生物的GC-MS總離子流圖示于圖4。

圖3 衍生溫度及時間對目標氨基酸衍生化效率的影響Fig.3 Effect of temperature on derivatization

1——丙氨酸；2——絲氨酸；3——谷氨酸；4——天冬酰胺；5——茶氨酸；6——谷氨酰胺 圖4 天然豐度氨基酸對照品(a)和15N標記氨基酸對照品(b)衍生物的GC-MS總離子流圖1——Alanine；2——Serine；3——Glutamic acid；4——Asparagine；5——Theanine；6——GlutamineFig.4 Total ion chromatograms of natural abundance (a) and high abundance 15N labeling (b) reference substance derivatives

根據(jù)氨基酸衍生物的出峰時間以及離子碎片信息，對15N標記的氨基酸衍生物進行定性分析。以谷氨酸為例，天然豐度的谷氨酸出峰時間為15.5 min，基峰為m/z246，EI質(zhì)譜圖如圖5a所示；15N標記亮氨酸的出峰時間與天然豐度相同，且只有1個N被15N取代，其基峰為m/z247，如圖5b所示。

天然豐度氨基酸和15N標記氨基酸具有相同的色譜行為，出峰時間相同。由于氨基酸中的N被15N取代個數(shù)的不同，從而具有不同的特征離子碎片，結果列于表1。

3.2.2不同15N豐度氨基酸的檢測方法精密度和準確度的驗證 茶葉中氨基酸的合成以及代謝是一個較為復雜的過程，受多種環(huán)境條件的影響，實際樣品中目標氨基酸的同位素豐度分布范圍較大。為了驗證在不同同位素豐度水平下所建立方法的準確度，利用不同比例的天然豐度氨基酸和高豐度氨基酸配制了15N同位素豐度為10%、20%、30%、50%、80%、98%的樣品對方法進行驗證(配制方法見2.1)，檢測結果列于表2。

圖5 天然豐度谷氨酸(a)和15N標記谷氨酸(b)EI圖譜(※：標記位置)Fig.5 Electron impact (EI) spectra of natural glutamic acid (a) and high abundance 15N labeling glutamic acid (b) (※: labeling site)

氨基酸分子式保留時間/min特征離子碎片m/z15N標記個數(shù)包含標記位點特征離子碎片m/z丙氨酸絲氨酸谷氨酸天冬酰胺茶氨酸谷氨酰胺C3H7NO2C3H7NO3C5H9NO4C4H8N2O3C7H14N2O3C5H10N2O36.811.315.816.017.517.9116204246188273245111122117205247189275247

表2 不同豐度的丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺測定結果的驗證Table 2 Isotope abundance of 15N labeling amino acids

續(xù)表2

注：同位素豐度：1) 10%15N；2) 20%15N；3) 30%15N；4) 40%15N；5) 80%15N；6) 98%15N。

由表2可見，連續(xù)3次進樣并計算同位素豐度，其精密度RSD小于0.6%。同位素豐度計算值與理論值基本相符，絕對偏差小于0.6%，說明方法在不同同位素豐度水平下均具有較好的準確度，同位素豐度計算方法可以滿足測定需求。

3.3 茶葉6種15N標記氨基酸的檢測

將茶葉樣品中的氨基酸進行提取和衍生化處理后，使用建立的方法進行分析，GC-MS離子流圖示于圖6。

1——丙氨酸；2——絲氨酸；3——谷氨酸；4——天冬酰胺；5——茶氨酸；6——谷氨酰胺 圖6 茶葉中氨基酸衍生化離子流圖1——Alanine；2——Serine；3——Glutamic acid；4——Asparagine；5——Theanine；6——GlutamineFig.6 Total ion chromatograms of amino acids derivatives in tea

由圖6中可以識別60余色譜峰，其中6種目標氨基酸均被檢出。目標氨基酸的保留時間與天然豐度對照品(見圖4a)相互對應，EI圖譜中特征離子與表1一致(如圖7所示)。通過特征離子質(zhì)量簇[22]，計算得出6種目標氨基酸的同位素豐度值列于表3。

a——丙氨酸；b——絲氨酸；c——谷氨酸；d——天冬酰胺；e——茶氨酸；f——谷氨酰胺 圖7 茶葉中目標氨基酸EI圖譜a——Alanine;b——Serine;c——Glutamic acid;d——Asparagine;e——Theanine;f——GlutamineFig.7 Electron impact (EI) spectra of targets in tea

天然氨基酸15N同位素豐度實驗組對照組丙氨酸絲氨酸谷氨酸天冬酰胺茶氨酸谷氨酰胺33.9%24.1%39.7%20.6%23.1%25.9%1.2%1.6%1.1%1.2%1.7%1.5%

由表3可以看出，實驗組中6種目標氨基酸的同位素豐度均顯著高于對照組，說明茶葉通過吸收15N標記的氮肥，經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化形成了15N標記的氨基酸，證實了相關代謝通路的存在。

4 結論

在優(yōu)化的衍生化條件下，建立了氣質(zhì)聯(lián)用測定茶葉中丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、茶氨酸、谷氨酰胺同位素豐度的檢測方法。通過對不同同位素豐度水平的樣品測定，驗證了方法的同位素檢測結果良好，同位素豐度絕對偏差小于0.6%，方法的精密度優(yōu)于0.6%。通過對茶葉實際樣品中六種氨基酸同位素豐度的測定可以看出，利用高豐度15N氮肥作為肥料的茶葉樣品其氨基酸的同位素豐度顯著高于對照組, 根據(jù)對不同采樣時間、不同條件下的茶葉中氨基酸同位素豐度的測定，可以系統(tǒng)地研究茶葉中氨基酸的轉(zhuǎn)化路徑及代謝循環(huán)規(guī)律，為茶葉品質(zhì)的研究提供依據(jù)。所建立的方法也可推廣至其他不同農(nóng)作物中氨基酸同位素豐度的檢測，為植物中氨基酸相關轉(zhuǎn)化路徑及代謝循環(huán)研究提供技術支持。

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