黃華

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科的常見病、多發(fā)病，大部分癲癇患者經(jīng)合理的用藥治療基本可以控制發(fā)作，但仍有約1/3的患者對抗癲癇藥物發(fā)生耐藥，最終不能終止其發(fā)作而發(fā)展成耐藥性癲癇[1-2]。該病的診治是臨床神經(jīng)內(nèi)科公認(rèn)的一大難題，也成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點[3]。耐藥性癲癇的發(fā)病機制尚不明確，近年來研究認(rèn)為P-糖蛋白(P-pg)和多藥耐藥基因(MDR1)的表達(dá)異?？赡苁悄退幮园d癇患者耐藥的重要原因之一，它們均屬于多藥耐藥轉(zhuǎn)運體，具有藥物外排泵功能，可以將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥[4-5]。本研究選取本院收治的耐藥性癲癇患者作為研究對象，對癲癇患者外周血以及腦脊液中多藥耐藥基因-1、P-糖蛋白水平進(jìn)行檢測，以探討這兩項指標(biāo)與癲癇多藥耐藥的關(guān)系，為癲癇患者耐藥發(fā)生機制的研究以及臨床診治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月-2016年4月本院收治的耐藥性癲癇患者85例作為耐藥性癲癇組，所有患者均有典型癲癇發(fā)作史及腦電圖表現(xiàn)，并符合難治性癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男46例，女39例，年齡16～51歲，平均年齡(35.1±10.2)歲，病程3～10年，平均病程(5.1±3.2)年，部分性發(fā)作3例，全面強直痙攣發(fā)作15例，部分性發(fā)作繼發(fā)全面強直9例，2種或2種以上發(fā)作形式18例；選取同期在本院接受治療的抗癲癇藥物治療控制良好的癲癇患者45例作為治療有效組，其中男25例，女20例，年齡17～53歲，平均年齡(35.7±11.1)歲，病程3～9年，平均病程(4.8±2.9)年，部分性發(fā)作2例，全面強直痙攣發(fā)作17例，部分性發(fā)作繼發(fā)全面強直10例，2種或2種以上發(fā)作形式16例。另選取體檢健康者45例作為健康對照組，其中男20例，女20例，年齡16～50歲，平均年齡(34.9±10.4)歲，所有人員各項體檢指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，均無癲癇發(fā)作史和癲癇藥物暴露史。研究均是在所有受試人員知情并同意情況下進(jìn)行。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)[6]

耐藥性癲癇組患者納入標(biāo)準(zhǔn)為(1)符合耐藥性癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即無中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性疾病或占位性病變，應(yīng)用2種以上一線抗癲癇藥正規(guī)治療2年以上且藥物血濃度在有效范圍內(nèi)，仍不能控制且影響日常生活；(2)除癲癇外，無神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史和家族史；(3)無肝、腎、心臟等重要器官及全身系統(tǒng)性疾??；(4)近半年未應(yīng)用激素和其他影響免疫的藥物。

1.3 P-糖蛋白表達(dá)水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)檢測P-糖蛋白表達(dá)水平，檢測方法如下：(1)所有受試者于清晨空腹采集靜脈血2 mL，同時采集耐藥性癲癇組和治療有效組患者腦脊液2 mL，離心后分別取靜脈血和腦脊液上清液，用包被液分別按1∶160和1∶40兩種比例稀釋，加入到酶標(biāo)板中，每點2孔，同一板上設(shè)陰性對照(加抗原不加一抗)，37 ℃ 3 h或4 ℃過夜，甩去孔中液體；(2)用95%乙醇固定10 min，用洗滌液(0.02 mol/L三羥甲基氨基甲烷-0.05%吐溫緩沖液)洗滌3次，每次5 min，甩去孔中液體，每孔加入100 uL非免疫血清封閉，室溫放置30 min后棄去上清液，P-GP抗體用稀釋液按1∶100稀釋，每孔加入100 uL；(3)37 ℃ 1 h或4 ℃過夜，甩去孔中液體，用洗滌液洗滌3次，每次5 min，每孔加入100 μL生物素標(biāo)記的第二抗體；(4)室溫30 min后甩去孔中液體，每孔加入100 uL鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶溶液；(5)室溫30 min，甩去上清液，用洗滌液洗滌3次，每次5 min，每孔加入OPD底物(鄰苯二胺、檸檬酸緩沖液、雙氧水)，20 min后立即加2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；(6)將培養(yǎng)板放在Dynatech MR 4000型ELISA讀數(shù)儀上測OD值，參考波長570 nm，檢測波長490 nm。

1.4 MDR1-mRNA表達(dá)水平檢測

采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測MDR1-mRNA表達(dá)水平。(1)將3 mL全血及腦脊液用 EDTA抗凝，提取白細(xì)胞，在白細(xì)胞沉淀中加入l mL RNA抽提試劑(Trizol液)，用帶針頭的注射器反復(fù)吹打直至打碎；(2)室溫靜置5 min后加入氯仿200 uL，用力振搖離心管，于室溫放置3 min，13000轉(zhuǎn)/min高速離心15 min，小心移取上層水液500 uL至1.5 mL離心管中；(3)加入500 uL異丙醇徹底混勻，室溫放置10 min，使RNA沉淀，13000轉(zhuǎn)/min 4 ℃高速離心15 min，棄去上層液體；(4)向沉淀中加入DEPC處理的75%乙醇l mL，將沉淀吹打懸浮，13000轉(zhuǎn)/min 4 ℃高速離心5 min，棄去上層液體；加入75%乙醇1 mL再次洗滌，再次離心5 min，棄上清液；(5)在無菌室中倒掉乙醇溶液，空氣中自然干燥，20 uL DEPC水溶解；(6)參照美國產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行cDNA合成，逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA用作PCR反應(yīng)的模板，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?7)引物合成。MDR1基因引物和熒光探針設(shè)計為Primer1:5’-GAT ACA TGG TTT TCC GAT CCA TG-3’；Primer2:5’-CAG TGG TGT TTT TTA GGG TCA TCA A-3’；MGB probe：5’-FAM-CAACTCACATCCTGTCTGA-MGB-3’，產(chǎn)物全長69 bp，跨過2個內(nèi)含子，包括探針結(jié)合序列；(8)用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)體積為30 uL，反應(yīng)體系10×buffer 3 μL，MgCl21.5 mmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，上下游引物、熒光探針各0.5 μmol/L，Tag DNA聚合酶1.0 U，cDNA模板3 μL。PCR反應(yīng)條件為93 ℃ 2 min預(yù)變性，然后按93 ℃ 30 s、60 ℃60 s在PE7300熒光定量PCR分析儀上共行40個循環(huán)，由電腦自動分析計算MDR1-mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 耐藥性癲癇組、治療有效組及健康對照組的血清及腦脊液中P-糖蛋白表達(dá)水平

耐藥性癲癇組：共85例，血清P-糖蛋白OD值為1.93±0.17，腦脊液P-糖蛋白OD值為2.11±0.38；治療有效組：共45例，血清P-糖蛋白OD值為0.56±0.08，腦脊液P-糖蛋白OD值為0.74±0.15；健康對照組：共85例，血清P-糖蛋白OD值為0.50±0.11。耐藥性癲癇組與治療有效組、健康對照組比較，耐藥性癲癇組患者血清P-糖蛋白表達(dá)水平較其他2組均明顯增高(P<0.05，P<0.01)，治療有效組與健康對照組比較，血清P-糖蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)；耐藥性癲癇組與治療有效組比較，腦脊液P-糖蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)(表1)。

表1 3組血清及腦脊液中P-糖蛋白表達(dá)水平,OD)

注：與耐藥性癲癇組比較，*P<0.05，△P<0.01

2.2 耐藥性癲癇組、治療有效組及健康對照組的血清及腦脊液中MDR1-mRNA表達(dá)水平

耐藥性癲癇組：共85例，血清MDR1-mRNA表達(dá)水平為(2.21±2.42)×106；腦脊液MDR1-mRNA表達(dá)水平為(8.62±9.25)×104，治療有效組：共85例，血清MDR1-mRNA表達(dá)水平為(7.92±8.11)×104，腦脊液MDR1-mRNA表達(dá)水平為(9.32±9.75)×102，健康對照組：共85例，血清MDR1-mRNA表達(dá)水平為(1.21±2.54)×104。耐藥性癲癇組與治療有效組、健康對照組比較，耐藥性癲癇組患者血清MDR1-mRNA表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05，P<0.01)，治療有效組與健康對照組比較，血清MDR1-mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)；耐藥性癲癇組與治療有效組比較，腦脊液MDR1-mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)(表2)。

表2 3組血清及腦脊液中MDR1-mRNA表達(dá)水平,copies/mL)

注：與耐藥性癲癇組比較，*P<0.05，△P<0.01

2.3 耐藥性癲癇組中不同發(fā)作類型患者血清MDR1-mRNA、P-糖蛋白表達(dá)水平

耐藥性癲癇組中不同發(fā)作類型患者血清MDR1-mRNA、P-糖蛋白表達(dá)水平比較均無明顯差異(P>0.05)(表3)。

表3 難治性癲癇組中不同發(fā)作類型患者血清MDR1-mRNA、P-糖蛋白表達(dá)水平)

3 討 論

耐藥性癲癇臨床上又稱頑固性癲癇，通常指無中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性疾病或占位性病變，但經(jīng)2年以上正規(guī)抗癲癇治療，抗癲癇藥達(dá)到患者能耐受最大劑量，血藥濃度達(dá)到有效范圍，每月仍有4次以上發(fā)作，則判斷為耐藥性癲癇[7-9]。該病的發(fā)病原因尚不清楚，可能是多種因素共同作用的結(jié)果，目前的研究還沒有能夠提出一種明確的藥理學(xué)機制，但耐藥性癲癇患者通常對若干種抗癲癇藥物都發(fā)生耐藥，而不是選擇性地對某種特殊類型的抗癲癇藥不敏感， 這一現(xiàn)象使人們不難推測，在該病的發(fā)病機制中存在一種共同的機制[10-12]。借鑒于腫瘤學(xué)耐藥的研究，人們發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族的成員多藥耐藥基因-1和P-糖蛋白在癲癇患者耐藥方面起到了重要作用，它們均屬于跨膜藥物轉(zhuǎn)運蛋白，具有藥物外排泵的功能，可以減少藥物在細(xì)胞間隙、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的聚集[13-14]。P-糖蛋白是多藥耐藥基因-1的編碼產(chǎn)物，在正常人組織中廣泛表達(dá)，但機體在病理狀態(tài)下會表達(dá)過度，泵出多種達(dá)到或已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物，使靶細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低[15]。本研究結(jié)果顯示，耐藥性癲癇組與治療有效組、健康對照組比較，耐藥性癲癇組患者血清及腦脊液P-糖蛋白及MDR1-mRNA表達(dá)水平較其他2組均明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，治療有效組與健康對照組比較，血清P-糖蛋白及MDR1-mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)，這進(jìn)一步證實多藥耐藥基因-1和P-糖蛋白與耐藥性癲癇患者的耐藥存在一定關(guān)聯(lián)。由此提示，外周血及腦脊液中多藥耐藥基因-1、P-糖蛋白的表達(dá)水平可以作為癲癇耐藥的一項重要指標(biāo)，在癲癇患者用藥期間要定期檢查患者多藥耐藥基因-1和P-糖蛋白的表達(dá)水平，若治療過程中發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)逐漸升高，則提示要注意耐藥的發(fā)生，則需醫(yī)生制定合理的治療方案，針對性地選擇治療藥物，防止因聯(lián)合用藥本身誘導(dǎo)難治性癲癇的產(chǎn)生，降低耐藥性癲癇的發(fā)生概率。但由于本研究所選樣本數(shù)量有限，僅為本地區(qū)的部分患者，還應(yīng)在以后的有關(guān)研究中擴大選取范圍，增加研究樣本，以便得到更加科學(xué)的實驗結(jié)果。

綜上所述，外周血及腦脊液中多藥耐藥基因-1、P-糖蛋白的表達(dá)水平可以作為癲癇耐藥的重要指標(biāo)。

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