曹玉霖，李 飛，趙 歡，歐 愚，張薇薇，朱彥鋒

前列腺癌是男性生殖系常見的惡性腫瘤之一，在西方國家發(fā)病率僅次于肺癌，是第二位的男性癌癥致死病因[1]。前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展依賴于雄激素，目前雄激素剝奪治療是前列腺癌患者的一線治療方法，雄激素剝奪治療在前列腺癌早期有效，但大多數(shù)患者在治療14～30個(gè)月后便進(jìn)入“去勢抵抗”階段，發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)[2]，傳統(tǒng)的化學(xué)治療對(duì)CRPC療效欠佳，其平均生存期僅為2～3年。前列腺癌向去勢抵抗性前列腺癌轉(zhuǎn)變的機(jī)制目前尚不清楚。

染料木黃酮(Genistein, GEN)是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于豆莢類植物中，是一種天然植物雌激素，有確切預(yù)防癌癥的作用[3]。研究[4-5]顯示，通過膳食攝入的GEN可以預(yù)防和治療相關(guān)疾病，特別是對(duì)乳腺癌、前列腺癌有積極的預(yù)防和治療作用。大量研究證實(shí)，GEN有抗前列腺癌活性，主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖[6-7]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]、抑制腫瘤血管形成[9]，以及對(duì)抗癌藥物的協(xié)同增敏作用。GEN還能降低早期前列腺癌患者血清前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)水平[10]。目前，關(guān)于GEN治療前列腺癌后期的CRPC的發(fā)生和發(fā)展的作用及機(jī)制研究較少。該研究旨在探討GEN對(duì)雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞的抑制作用。通過建立雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞的模型,在體外模擬雄激素依賴性前列腺癌進(jìn)展為雄激素非依賴性前列腺癌的過程。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑LNCaP細(xì)胞(成都哈里生物公司)；無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液(以色列Biological Industries公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；GEN、DMSO(美國Sigma公司)；CCK-8(南京凱基公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司)；兔抗人PSA、兔抗人P53、兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、兔抗人細(xì)胞周期蛋白(CyclinD1)、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)、p-PI3K蛋白、絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、p-AKT蛋白抗體(美國Abcam公司)；山羊抗兔IgG、鼠抗人β-actin及山羊抗鼠IgG單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1雄激素非依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞株的建立 雄激素依賴性LNCaP細(xì)胞用常規(guī)含10%胎牛血清的無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)3周傳代3次后，血清改用經(jīng)活性碳/葡聚糖處理的胎牛血清，平均每3 d換液1次，每6 d傳代1次，連續(xù)傳代40次共8個(gè)月。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)箱。

1.2.2CCK-8檢測雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞生長情況 在96孔板中接種處于對(duì)數(shù)生長期的雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞，每孔培養(yǎng)5 000個(gè)細(xì)胞。5% CO2、37 ℃孵育，孵育24 h后，去掉舊培養(yǎng)液，每孔加入不同濃度的GEN工作液100 μl (7個(gè)濃度組: 0、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)，每個(gè)濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。GEN 0 μmol/L組為對(duì)照組。孵育24、48、72 h 后，每孔再加入100 μl含10% CCK-8的培養(yǎng)液，孵育4 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(optical density,OD)。根據(jù)公式: 抑制率(%)= (1-加藥組OD/對(duì)照組OD)×100%，計(jì)算不同濃度組GEN對(duì)雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞的抑制率。

1.2.3Western blot法檢測蛋白的表達(dá) 6個(gè)濃度組的GEN處理LNCaP細(xì)胞72 h后，加入蛋白酶抑制劑和裂解液的混合物，在冰上裂解30 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，用BCA法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量并分裝保存于-70 ℃。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，利用80 V(濃縮膠) /120 V(分離膠) 電壓對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，在100 V 恒壓條件下轉(zhuǎn)移1.5 h。PVDF膜用TBST沖洗并浸入5%脫脂牛奶中封閉，振蕩1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，分別加入兔抗人PSA、兔抗人PCNA、兔抗人Cyclin D1、兔抗人P53、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT單克隆抗體(1 ∶1 000)，搖床4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG (1 ∶5 000)，室溫下孵育1.5 h。TBST洗膜3次，每次10 min。通過凝膠成像儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行曝光成像，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的光密度比值評(píng)價(jià)其表達(dá)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞模型的建立正常LNCaP細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代3次后，改用無激素?zé)o酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)傳代40次。在活性碳/葡聚糖處理的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞呈梭形貼壁生長，培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞開始向外伸出許多突觸，培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞長至80%。正常LNCaP細(xì)胞和雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞在40倍顯微鏡下的形態(tài)見圖1。

圖1 雄激素依賴性和雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞在顯微鏡下形態(tài) ×40

A:雄激素依賴性LNCaP細(xì)胞；B：雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)40代后

2.2雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞模型的驗(yàn)證正常LNCaP細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞去激素培養(yǎng)20代、40代后，利用Western blot法檢測PSA蛋白的表達(dá)，用凝膠成像儀分析電泳結(jié)果，圖2顯示LNCaP細(xì)胞內(nèi)PSA的表達(dá)水平隨著去激素培養(yǎng)代數(shù)的增加而逐漸降低。

圖2 正常LNCaP細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞去激素培養(yǎng)20代、40代的PSA表達(dá)水平

2.3GEN對(duì)雄激素依賴性LNCaP和雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞增殖的影響CCK-8法檢測不同濃度的GEN(0、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L) 分別作用于雄激素依賴性LNCaP細(xì)胞和雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞24、48、72 h后的增殖影響。結(jié)果顯示:GEN作用于雄激素依賴性LNCaP細(xì)胞和雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞后，對(duì)其增殖具有明顯的抑制作用，且具有劑量、時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05)。見表1、2。

表1 不同濃度GEN對(duì)雄激素依賴性LNCaP細(xì)胞體外增殖的影響

與對(duì)照組比較：*P<0.05

表2 不同濃度GEN(μmol/L)對(duì)雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞體外增殖的影響

與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.4不同濃度GEN對(duì)雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞周期蛋白的影響GEN 處理雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞72 h后，Western blot法檢測結(jié)果顯示，GEN能上調(diào)LNCaP細(xì)胞中P53的表達(dá)，下調(diào)了增殖抗原PCNA及周期蛋白CyclinD1的表達(dá)。見圖3。

圖3 不同濃度GEN處理72 h對(duì)PCNA、CyclinD1、P53表達(dá)的影響

2.5對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用為了進(jìn)一步探討GEN抑制LNCaP生長的分子機(jī)制，檢測了PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)，結(jié)果顯示，100 μmol/L的GEN和陰性對(duì)照組(0 μmol/L GEN)處理雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞48 h后,PI3K和AKT的磷酸化明顯受到抑制，見圖4。

3 討論

CRPC是前列腺癌終末期的表現(xiàn)，大多數(shù)患者最終會(huì)對(duì)現(xiàn)有的常規(guī)抗腫瘤化療藥物產(chǎn)生抗性而失效，因此，如何延緩CRPC的產(chǎn)生是當(dāng)前治療前列腺癌的重點(diǎn)之一。大量研究[11-12]表明，大豆異黃酮能夠抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等抗腫瘤效應(yīng)，對(duì)預(yù)防和治療前列腺癌具有重要意義。但大豆異黃酮對(duì)前列腺癌治療后期的CRPC的發(fā)生和發(fā)展的作用及機(jī)制研究較少。

圖4 100 μmol/L的GEN處理48 h對(duì)PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表達(dá)的影響A：陰性對(duì)照組；B：100 μmol/L GEN

本研究中采用了CRPC代表細(xì)胞株LNCaP作為實(shí)驗(yàn)株，在體外建立了雄激素非依賴性生長的細(xì)胞模型。研究GEN對(duì)雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞增殖與凋亡的影響并探討其作用機(jī)制。

CCK-8法提示，隨著GEN濃度的增高，LNCaP細(xì)胞和雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)出時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。

Cyclin D1的過度表達(dá)會(huì)改變細(xì)胞周期進(jìn)程。研究[13]顯示GEN抑制22RV1細(xì)胞增殖可能是通過下調(diào)CyclinD1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。Cyclin D1 基因過表達(dá)和基因擴(kuò)增在多種腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。本研究顯示GEN濃度大于25 μmol/L時(shí)可顯著抑制LNCaP細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)。

腫瘤細(xì)胞的增殖活性旺盛，PCNA可作為評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，隨著細(xì)胞增殖周期的不同，其含量發(fā)生相應(yīng)的變化。p53是一種腫瘤抑制基因，50%以上的惡性腫瘤會(huì)出現(xiàn)該基因的突變。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)GEN能抑制CRPC細(xì)胞中PCNA表達(dá)，而上調(diào)P53蛋白的表達(dá)，這提示GEN能夠抑制CRPC細(xì)胞的增殖。Zhao et al[14]研究發(fā)現(xiàn)GEN在10 μmol/L時(shí)能上調(diào)P53的表達(dá)，阻滯LNCaP細(xì)胞在G2/M 期，與本研究作用濃度(12.5 μmol/L) 相符。

PI3K/AKT信號(hào)通路參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[15]，目前以PI3K-AKT信號(hào)通路關(guān)鍵分子為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略正在發(fā)展中。Western blot結(jié)果顯示，100 μmol/L的GEN處理雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞48 h后，PI3K和AKT的磷酸化明顯受到抑制，而PI3K和AKT的總蛋白水平?jīng)]有明顯變化。說明GEN處理雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞后，抑制細(xì)胞增殖，可能與其下調(diào)PI3K和AKT磷酸化水平，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本研究建立了雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞的體外生長模型，結(jié)果顯示GEN可以顯著抑制雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞的生長，并能下調(diào)Cyclin D1、PCNA的表達(dá)。GEN抑制雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制與下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。本研究證實(shí)了染料木黃酮對(duì)CRPC的“化學(xué)預(yù)防”作用。

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