王 樾，吳文涌 綜述 吳正升 審校

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，其中癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)是細(xì)胞癌變的重要原因之一。鼠雙微體基因2(murine doubleminute 2，MDM2)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，是一種與惡性腫瘤密切相關(guān)的癌基因[1]。它是一種泛素-蛋白連接酶，參與泛素對(duì)靶蛋白的標(biāo)識(shí)，進(jìn)而導(dǎo)致靶蛋白通過(guò)蛋白酶體而被降解，其編碼的蛋白質(zhì)可以與p53蛋白結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)p53蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致抑癌基因p53的失活，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化、增殖和惡變的能力增強(qiáng)[2]。在人類腫瘤中，MDM2蛋白的過(guò)度表達(dá)可以由基因擴(kuò)增引起，在基于28種不同類型的腫瘤，約4 000個(gè)腫瘤樣本的分析中顯示，MDM2基因平均在約7%的腫瘤樣本中擴(kuò)增，擴(kuò)增幅度為2～10倍[3]。MDM2和p53通過(guò)負(fù)反饋環(huán)路相互調(diào)節(jié)[4]，因此靶向MDM2的藥物可以重新活化野生型p53，通過(guò)利用p53強(qiáng)大的腫瘤抑制功能，該類藥物可能實(shí)現(xiàn)治療人類癌癥的潛能。該文概述了靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑在抗癌治療中的研究進(jìn)展。

1 MDM2基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其與p53的相互作用

MDM2最初由Linda et al[5]從含有雙微體的自發(fā)轉(zhuǎn)化小鼠Balb/c3T3成纖維細(xì)胞系(3T3DM)中克隆出來(lái)的一個(gè)高度擴(kuò)增的基因。該基因在進(jìn)化過(guò)程中保守，不同物種細(xì)胞染色體上都有其同源序列。1992年，Oliner et al[6]在染色體12q13-14上鑒定出人MDM2基因。人MDM2基因的cDNA開(kāi)放閱讀框?yàn)?'端到第1784位核苷酸，起始密碼ATG從312位核苷酸開(kāi)始，第181～185位密碼子為核定位信號(hào)，第305～322位密碼子為酸性活化域。進(jìn)一步研究[7]顯示MDM2蛋白具有4個(gè)功能區(qū)：I區(qū)包括N端約100個(gè)氨基酸殘基，是MDM2-p53相互結(jié)合的部位，也可以直接結(jié)合到基因啟動(dòng)子上，激活基因轉(zhuǎn)錄；II區(qū)為高度酸性區(qū)域，能與核糖體15蛋白及5s rRNA結(jié)合；III區(qū)含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，具有轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期；IV區(qū)含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，也能結(jié)合DNA或RNA，參與細(xì)胞周期調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

p53可分為野生型p53和突變型p53兩種，是目前研究最為深入的抑癌基因[8]，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡中起著重要作用。野生型p53是抑癌基因，當(dāng)外界因素使DNA受到損傷且難以修復(fù)時(shí)快速誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，防止具有潛在癌變可能性的細(xì)胞產(chǎn)生，從而有效地發(fā)揮抑癌作用。當(dāng)野生型p53轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃蚿53時(shí)，突變型p53起到了原癌基因的作用，在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)積累，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9]。MDM2為p53的下游效應(yīng)基因之一，同時(shí)可以與p53的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，即N端結(jié)合，從而抑制p53對(duì)其下游基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)功能。這種作用機(jī)制在p53與MDM2間建立了一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)[10]。在DNA損傷時(shí)，機(jī)體需要p53的臨時(shí)活化來(lái)抑制異?；蚴軗p細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，并誘導(dǎo)受損及異常細(xì)胞的DNA修復(fù)或凋亡。此時(shí)，p53會(huì)發(fā)生明顯的磷酸化，使MDM2與p53的結(jié)合力降低，從而降低MDM2對(duì)p53的抑制作用。當(dāng)p53失去了MDM2對(duì)其的抑制作用后，就可以有效地增加下游基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或凋亡[11]。MDM2主要通過(guò)三種機(jī)制調(diào)節(jié)p53的功能：① MDM2和p53在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合后，通過(guò)其E3泛素連接酶活性直接泛素化p53，促進(jìn)p53發(fā)生蛋白酶體降解；② MDM2與p53的相互作用阻斷了p53與其靶DNA的結(jié)合，使p53成為無(wú)效的轉(zhuǎn)錄因子；③ MDM2促進(jìn)p53從細(xì)胞核中輸出，使p53無(wú)法與靶DNA結(jié)合，進(jìn)一步降低其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力[7,12-13]。因此，當(dāng)MDM2對(duì)p53的抑制過(guò)強(qiáng)時(shí)，DNA受損傷的細(xì)胞就可以繼續(xù)增殖從而導(dǎo)致腫瘤形成。MDM2蛋白通過(guò)抑制p53的轉(zhuǎn)錄活化功能和抗腫瘤活性，促進(jìn)腫瘤的形成，并與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)[14]。

2 靶向MDM2-p53相互作用的抗癌治療

MDM2依賴于其與p53相互作用的幾種機(jī)制來(lái)抑制p53功能，所以設(shè)計(jì)用于阻斷MDM2-p53相互作用的肽類或非肽類小分子可以導(dǎo)致p53蛋白的增加，利用p53強(qiáng)大的腫瘤抑制功能，這類化合物可能具有治療人類癌癥的潛能。生物化學(xué)研究[15]表明MDM2和p53是通過(guò)MDM2蛋白氨基末端的120個(gè)氨基酸殘基和p53蛋白氨基末端的30個(gè)氨基酸殘基相互作用的。對(duì)p53蛋白N端的11個(gè)氨基酸和MDM2蛋白N端109個(gè)氨基酸片段的復(fù)合物進(jìn)行晶體X線衍射研究，顯示MDM2-p53結(jié)合界面的表面積為14.98 nm2，二者之間主要以疏水作用結(jié)合[16]。MDM2疏水裂隙界面上排列有14個(gè)芳香性和疏水性氨基酸，p53疏水面與MDM2螺旋結(jié)合，另一側(cè)與MDM2折疊接近，使Phe19、Trp23和Leu26嵌入到MDM2疏水裂隙中，結(jié)合界面另有兩處分子間以氫鍵相連。這些結(jié)構(gòu)特征為設(shè)計(jì)能夠阻斷MDM2-p53相互作用的非肽類藥的小分子抑制劑提供了可行性。下面介紹幾類靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑，見(jiàn)表1。

2.1第一個(gè)靶向MDM2-p53相互作用的強(qiáng)效、特異的小分子抑制劑Nutlins盡管高校實(shí)驗(yàn)室和制藥公司進(jìn)行了大量的研究工作，但設(shè)計(jì)靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑比預(yù)期要困難得多。隨著美國(guó)羅氏公司的Vassilev et al[17]發(fā)現(xiàn)了Nutlins打破了這一局面。在最初的關(guān)于Nutlins的報(bào)道顯示[17]，Nutlin-3a以90×10-9mol/L的半數(shù)最大抑制濃度值(half-maximal inhibitory concentration，IC50)從MDM2-p53相互作用中置換出p53，并且表現(xiàn)出與p53結(jié)合MDM2相一致的作用機(jī)制。Nutlin-3a有效地激活癌細(xì)胞中的野生型p53，通過(guò)劑量依賴的方式保留了野生型p53的抑制癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的作用，并對(duì)p53突變或p53缺失的癌細(xì)胞系表現(xiàn)出>10倍的選擇性。Nutlin-3a具有口服的生物藥效性，每日兩次口服給藥(高劑量:100或200 mg/kg)的情況下，可有效抑制含有MDM2基因擴(kuò)增的人骨肉瘤細(xì)胞系SJSA-1的小鼠異種移植瘤模型中腫瘤的生長(zhǎng)，而小鼠并未顯示中毒跡象。Nutlin-3a的類似物Nutlin-2與MDM2復(fù)合物的共晶體結(jié)構(gòu)顯示，該Nutlins模擬三個(gè)關(guān)鍵的p53結(jié)合殘基(Phe19、Trp23和Leu26)[17]。在應(yīng)用Nutlins所獲得的臨床前數(shù)據(jù)顯示，靶向MDM2-p53相互作用的高效、選擇性、非肽類的小分子抑制劑可能具有保留野生型p53功能，治療人類癌癥的潛力[17]。Nutlins的發(fā)現(xiàn)同時(shí)也激勵(lì)著其他研究小組去探索具有更加高效和選擇性，具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)的新型MDM2抑制劑。

2.2第一個(gè)進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)的MDM2抑制劑RG7112來(lái)自美國(guó)羅氏公司的科學(xué)家通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化Nutlin-3a的細(xì)胞效能、藥代動(dòng)力學(xué)特性、化學(xué)穩(wěn)定性及對(duì)MDM2的親和力，發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)的MDM2抑制劑RG7112(RO5045337)[18]。RG7112與MDM2的親和力(IC50=18×10-9mol/L)比Nutlin-3a更好，其有效地抑制了含有野生型p53的癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，并且比Nutlin-3a的效力高數(shù)倍，同時(shí)對(duì)具有突變型p53的癌細(xì)胞系顯示出良好的選擇性。RG7112在體內(nèi)外試驗(yàn)中有效地激活了野生型p53，并在小鼠中顯示出良好的口服藥代動(dòng)力學(xué)特性[18]。在具有MDM2基因擴(kuò)增和蛋白過(guò)表達(dá)的SJSA-1和MHM骨肉瘤細(xì)胞系的兩種小鼠異種移植瘤模型中，通過(guò)口服RG7122表現(xiàn)出劑量依賴性地抑制腫瘤生長(zhǎng)，并且能夠達(dá)到腫瘤部分消退，且小鼠未顯示中毒跡象[18]。

表1 靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑的來(lái)源、結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

2.3其他靶向MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑采用基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)策略，Ding et al[24]開(kāi)發(fā)出了一類稱為螺-羥吲哚類化合物的、新型的非肽小分子MDM2抑制劑。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行廣泛的優(yōu)化，于是發(fā)現(xiàn)了MI-77301[19]和MI-888[20,25]，它們結(jié)合MDM2的抑制常數(shù)Ki值分別為0.88×10-9mol/L和0.44×10-9mol/L，并且在結(jié)合力測(cè)定中比Nutlin-3a的效能強(qiáng)50倍以上。在人類癌細(xì)胞系中,MI-77301和MI-888在30×10-9～100×10-9mol/L濃度時(shí)均能有效激活野生型p53；與其對(duì)MDM2的更高的親和力和更高的p53活化能力一致，這兩種化合物在抑制含有野生型p53的癌細(xì)胞系增殖方面比Nutlin-3a顯示出高10倍的效能[19，25]，并且對(duì)擁有p53突變或p53缺失的癌細(xì)胞系顯示出>100倍的選擇性。在SJSA-1細(xì)胞系的小鼠異種移植瘤模型中，兩種化合物分別通過(guò)每日口服給藥，均能夠?qū)崿F(xiàn)完全和持久的腫瘤消退，而小鼠沒(méi)有顯示中毒跡象[19，25]。MI-77301與人MDM2蛋白復(fù)合物的共晶體結(jié)構(gòu)顯示，與其最初的設(shè)計(jì)一致，MI-77301模擬了三個(gè)關(guān)鍵的p53結(jié)合殘基，而且還參與額外的疏水鍵和氫鍵與MDM2相互作用；其中MI-77301中的取代苯基與MDM2的His96殘基具有π-π堆積作用；其還誘導(dǎo)MDM2氨基末端區(qū)域的非結(jié)構(gòu)性10-25位氨基酸殘基的重新折疊，使這些氨基酸殘基成為結(jié)合區(qū)域的一部分，并進(jìn)一步增加MDM2與MI-77301親和力[19]。

美國(guó)安進(jìn)公司的科學(xué)家們通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和廣泛地優(yōu)化發(fā)現(xiàn)了含有哌啶-2-酮支架結(jié)構(gòu)的AMG-232[21，26]。AMG-232與MDM2結(jié)合的親和力指數(shù)Kd值為0.045×10-9mol/L，并且AMG-232可能是迄今為止報(bào)道的最有效的MDM2抑制劑[26]，它分別以9.1×10-9mol/L和10×10-9mol/L的IC50值在SJSA-1和HCT-116細(xì)胞系中抑制細(xì)胞增殖，并且顯示出對(duì)p53基因敲除的HCT-116細(xì)胞系超過(guò)1 000倍的選擇性。AMG-232還可以有效抑制SJSA-1骨肉瘤細(xì)胞系異種移植瘤動(dòng)物模型中的腫瘤生長(zhǎng)，并在每天口服60 mg/kg AMG-232的12只動(dòng)物中有10只動(dòng)物實(shí)現(xiàn)了完全的腫瘤消退[21，26]。雖然AMG-232與MDM2復(fù)合物的共晶體結(jié)構(gòu)尚未明確，但有研究[21，26-27]AMG-232衍生物與MDM2復(fù)合物的幾種高分辨率共晶體結(jié)構(gòu)，并對(duì)AMG-232衍生物與MDM2復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的分析。這些共晶體結(jié)構(gòu)顯示，這類MDM2抑制劑也很好地模擬了與MDM2相互作用的三個(gè)關(guān)鍵的p53結(jié)合殘基。與MI-77301一樣，這類MDM2抑制劑同樣誘導(dǎo)了MDM2蛋白氨基末端的重組，并促進(jìn)了小分子抑制劑與MDM2中Val14和Thr16殘基之間額外的疏水鍵接觸[27]。

基于MI-77301的早期類似物MI-219，來(lái)自美國(guó)羅氏公司的科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)了一類新的MDM2抑制劑RG7388(RO5503781)[22]，并將其納入臨床研究。RG7388以6×10-9mol/L的IC50結(jié)合MDM2，有效的抑制含有野生型p53的癌細(xì)胞系生長(zhǎng)，并且對(duì)擁有p53突變的癌細(xì)胞系顯示出>100倍的選擇性。RG7388在動(dòng)物中具有良好的微粒體穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)特性，其在口服給藥的小鼠SJSA-1骨肉瘤細(xì)胞系異種移植瘤模型中實(shí)現(xiàn)腫瘤完全消退[22]。目前RG7388在實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中的作用正在進(jìn)行臨床研究。瑞士諾華公司最近公布了一類含有二氫異喹啉支架結(jié)構(gòu)的新一代MDM2抑制劑NVP-CGM097，并將其納入臨床研究[23]。NVP-CGM097在靶向MDM2-p53相互作用方面具有物種差異性，在人體內(nèi)比狗和大鼠體內(nèi)分別強(qiáng)效16和37倍。NVP-CGM097以1.7×10-9mol/L的IC50結(jié)合MDM2，比Nutlin-3a約有效4倍，在體內(nèi)外已被證明是一個(gè)強(qiáng)效且選擇性的MDM2抑制劑，目前正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)[23]。

3 MDM2抑制劑臨床試驗(yàn)結(jié)果

3.1RG7112的臨床試驗(yàn)結(jié)果RG7112是進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)的第一個(gè)MDM2抑制劑。因?yàn)槌^(guò)80%的脂肪肉瘤具有MDM2基因的擴(kuò)增和MDM2蛋白的過(guò)表達(dá)，所以在化療初治的脂肪肉瘤患者中評(píng)估了RG7112的治療效果，并報(bào)道了I期試驗(yàn)結(jié)果[28]。RG7112通過(guò)口服給藥可以獲得良好的人體藥代動(dòng)力學(xué)特性，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到p53的激活、p21蛋白的增加和凋亡誘導(dǎo)現(xiàn)像。根據(jù)實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在脂肪肉瘤患者中觀察到了RG7112的抗腫瘤活性，20例患者中有14例病情穩(wěn)定，1例患者出現(xiàn)病情好轉(zhuǎn)，其余5例患者(均為未分化肉瘤)出現(xiàn)了病情進(jìn)展。所有接受RG7112治療的患者至少有1例不良反應(yīng)事件，在8例患者中觀察到有12例嚴(yán)重不良事件，其中包括中性粒細(xì)胞減少癥(6例)和血小板減少癥(3例)。RG7112的臨床研究[28]數(shù)據(jù)表明，患者RG7112的血漿暴露與觀察到的血液學(xué)毒性相關(guān)，因此，晚期血液學(xué)毒性，特別是血小板減少癥，應(yīng)在MDM2抑制劑的未來(lái)臨床試驗(yàn)中加以充分考慮。

3.2其他MDM2抑制劑的臨床試驗(yàn)結(jié)果除RG7112外，至少6種其他MDM2抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床研發(fā)，但是目前僅僅公布了其中2種MDM2抑制劑的研究結(jié)果。

RG7388的I期臨床研究[29]數(shù)據(jù)已經(jīng)公布。RG7388的最大耐受劑量是500 mg，每日1次×5 d；500 mg，每日2次×3 d或者1 600 mg，每周2次。通過(guò)每日1次給藥，連續(xù)5 d，或每日2次給藥，連續(xù)3 d檢測(cè)p53的活化情況，結(jié)果表明前者給藥方案具有更強(qiáng)的p53活化功效。而每周2次給藥劑量情況下未觀察到確切的p53激活。血小板減少癥、中性粒細(xì)胞減少癥、發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少癥和腹瀉是RG7388的劑量限制性毒性反應(yīng)。FLT-PET顯示RG7388可以明顯減少腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)。推薦RG7388的II期臨床研究劑量為500 mg，每日1次，連續(xù)5 d的給藥方案。

法國(guó)賽諾菲公司首次評(píng)估了單藥MI-77301(SAR405838)用于晚期癌癥患者的安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)特性和生物活性。MI-77301單藥Ⅰ期臨床試驗(yàn)的初步研究結(jié)果在2015年第51屆美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)年會(huì)上發(fā)表[30]。MI-77301的最大耐受日劑量為300 mg，且在可接受的安全劑量范圍內(nèi)MI-77301激活了p53。對(duì)來(lái)自18個(gè)未分化脂肪肉瘤患者的血漿和腫瘤樣品的分析顯示，在MI-77301治療期間，患者的血漿游離DNA中出現(xiàn)了TP53(編碼p53蛋白)基因的突變。這是對(duì)MDM2抑制劑誘導(dǎo)p53突變進(jìn)行的首次研究，顯示所有的p53突變點(diǎn)位于p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，此外，在治療期間突變變異的等位基因頻率也增加，患者中出現(xiàn)了多樣性p53突變，且所有接受5個(gè)或更多療程治療的患者均顯示了血漿游離DNA中p53突變的證據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)高校實(shí)驗(yàn)室和制藥公司的大量研究工作，已成功設(shè)計(jì)和合成幾類可以結(jié)合MDM2并阻斷MDM2-p53相互作用的高效、特異性、非肽類小分子抑制劑。目前至少有7種這樣的化合物進(jìn)入癌癥治療的臨床研究，且這些優(yōu)化的MDM2抑制劑在動(dòng)物口服給藥方面表現(xiàn)出優(yōu)異的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，其中幾種MDM2抑制劑在人類腫瘤動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)了完全的腫瘤消退。來(lái)自RG7112、RG7388和MI-77301的初步臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，這些MDM2抑制劑在安全性的給藥劑量下有效激活了p53，并且觀察到確切的抗腫瘤活性的證據(jù)。這進(jìn)一步支持靶向MDM2-p53相互作用會(huì)導(dǎo)致野生型p53激活，并作為一種新的癌癥治療策略。

基于三種化合物(RG7112、RG7388和MI-77301)的Ⅰ期臨床研究數(shù)據(jù)表明，MDM2抑制劑可以激活患者的野生型p53，并具有可接受的安全性。然而，使用MDM2抑制劑過(guò)程中以下問(wèn)題還應(yīng)加以考慮：首先，由于骨髓中p53的活化引起的劑量限制性毒性，這必須通過(guò)劑量?jī)?yōu)化來(lái)緩解。其次，起初含有野生型p53的腫瘤在用MDM2抑制劑治療后出現(xiàn)了p53突變。由于基于臨床前研究數(shù)據(jù)的MDM2抑制劑僅對(duì)含有野生型p53的腫瘤有效，預(yù)期對(duì)具有突變型p53的腫瘤細(xì)胞具有抵抗性。為了克服這種藥物誘導(dǎo)的抵抗性問(wèn)題，在臨床前研究和臨床試驗(yàn)中，都應(yīng)探討MDM2抑制劑與有效殺滅含有突變型p53的腫瘤細(xì)胞的藥物聯(lián)合使用。

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