高 慧，肖芙蓉，許小珍，林 鋒，張秀春，吳 彪，趙貴先

(海南省人民醫(yī)院, 海南 ?？?570311)

流行性感冒(influenza，F(xiàn)lu)具有高度的傳染性，發(fā)病率高，病死率高，是危害人類健康的一種重要感染性疾病。特別是近年來(lái)甲型H1N1流感病毒感染在全世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，引起了全球的重視[1]。雖然奧司他韋是公認(rèn)治療甲型流感病毒的有效藥物，但已有耐藥的報(bào)道，且目前對(duì)于流感有確切療效的藥物較少，勢(shì)待研發(fā)新的藥物。草血竭(Polygonum paleaceum Wall，PPW)為蓼科植物的根莖，已有實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)急性炎癥有一定的治療作用。本文擬在流感病毒感染動(dòng)物模型上觀察其抗流感病毒的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 甲型H1N1 流感病毒Yamagata/120/86/H1N1 株由日本福島醫(yī)科大學(xué)微生物系錫谷達(dá)夫教授惠贈(zèng)，血凝滴度：1∶1 280。動(dòng)物：4～5 周齡Balb/c 小鼠，體重(11±1)g，購(gòu)自海南省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(鄂)4200593224。幼犬腎(Madin-Darby Canine Kidney, MDCK)細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存(購(gòu)自上海細(xì)胞所)。

1.2 試劑 草血竭純化部分(0.283 g/mL生藥，湖北中醫(yī)藥大學(xué)生產(chǎn))。奧司他韋(達(dá)菲，75 mg/粒，巴塞爾豪夫邁·羅氏公司，瑞士)。實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO，美國(guó))；青鏈霉素溶液(100×)(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；胰酶(Amresco 公司，美國(guó))； TRAZOL (Invitrogen公司，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、隨機(jī)引物(Promega 公司，美國(guó))；2×PCR mix 和PCR Markers[天根生化科技(北京)有限公司]；SYBR Green Real-time PCR Master Mix(TOYOBO 公司，日本)；dNTPs (華美生物工程公司)；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒[愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 甲型 H1N1流感病毒對(duì)Balb/c 小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定 將病毒液用稀釋液按10 倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-77 個(gè)稀釋度。取Balb/c小鼠48 只，隨機(jī)法分為8 組。乙醚輕度麻醉后，分別給予上述稀釋度的病毒液50 μL滴鼻，正常對(duì)照組使用無(wú)病毒的稀釋液滴鼻。每天觀察小鼠生存狀態(tài)，記錄14 d內(nèi)各組小鼠發(fā)病狀況，統(tǒng)計(jì)小鼠死亡數(shù)量，根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算流感病毒的LD50[2-3]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 Balb/c 小鼠，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、病毒對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(達(dá)菲45 mg/kg·d)、草血竭高劑量組(1 600 mg/kg·d)、草血竭中劑量組(800 mg/kg·d)、草血竭低劑量組(400 mg/kg·d)，每組7只。Balb/c 小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食禁水4 h，乙醚吸入麻醉后，以10×LD50病毒液滴鼻感染小鼠，每只小鼠的接種劑量為50 μL(正常對(duì)照組經(jīng)鼻腔滴入等量病毒稀釋液)。感染后2 h 通過(guò)灌胃途徑給予上述各劑量藥物，0.2 mL/只，連續(xù)給藥5 d，每天1 次。

1.3.3 療效評(píng)價(jià) 觀察14 d 內(nèi)甲型H1N1流感病毒感染模型小鼠的發(fā)病情況，記錄各組小鼠死亡數(shù)及存活日數(shù)。肺指數(shù)的測(cè)定：肺指數(shù)=小鼠肺重/小鼠體重×100%；肺指數(shù)抑制率=(病毒對(duì)照組肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組肺指數(shù))/病毒對(duì)照組肺指數(shù)×100%。最后一次灌胃給藥后繼續(xù)觀察24 h，小鼠處死前禁食禁水8 h 以上。稱重后先摘除眼球取血，再將小鼠斷椎處死，無(wú)菌取肺，用生理鹽水洗滌2～3 次，摘除氣管及肺門淋巴組織，置于濾紙上吸干水分后，精密天平稱重。肺組織內(nèi)病毒核酸載量：對(duì)肺組織勻漿提取RNA，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量同一樣本各組小鼠肺內(nèi)流感病毒M基因相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量[4]。小鼠肺組織勻漿液，接種至已鋪滿單層的MDCK細(xì)胞上進(jìn)行流感病毒擴(kuò)增，血凝試驗(yàn)法檢測(cè)流感病毒滴度[5-7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。多組間比較采用方差分析，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲型H1N1流感病毒對(duì)Balb/c小鼠LD50的測(cè)定 甲型H1N1流感病毒對(duì)Balb/c小鼠的LD50為10-6。見(jiàn)表1。

表1 甲型H1N1流感病毒對(duì)小鼠的LD50

2.2 草血竭純化部分對(duì)甲型H1N1流感病毒感染小鼠的作用 陽(yáng)性對(duì)照組和草血竭高、中劑量組小鼠的存活率均為100%，平均生存日數(shù)均為14 d，草血竭低劑量組小鼠的存活率為42.86%，平均生存日數(shù)為9.14 d，而病毒對(duì)照組小鼠的存活率及平均生存日數(shù)分別為0 和3.57 d。 不同組別小鼠平均生存日數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.53，P=0.02)；陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠平均生存日數(shù)均高于病毒對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 草血竭純化部分對(duì)甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺指數(shù)、肺組織病毒載量的影響 陽(yáng)性對(duì)照組和草血竭純化部分各劑量組的肺指數(shù)、肺組織內(nèi)流感病毒核酸相對(duì)量和病毒滴度均低于病毒對(duì)照組(P<0.05)。而陽(yáng)性對(duì)照組與草血竭純化部分各劑量組的肺指數(shù)、肺組織內(nèi)流感病毒核酸相對(duì)量和病毒滴度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2草血竭純化部分對(duì)甲型H1N1 流感病毒感染小鼠的死亡保護(hù)作用

Table2Protection effect of extract of PPW on death of mice infected with influenza A H1N1 virus

組別死亡比例病死率(%)存活率(%)平均生存日數(shù)(x±s,d)高劑量組0/70.00100.0014.00±0.00*中劑量組0/70.00100.0014.00±0.00*低劑量組4/757.1442.869.14±4.56*陽(yáng)性對(duì)照組0/70.00100.0014.00±0.00*病毒對(duì)照組7/7100.000.003.57±0.79正常組0/70.00-14.00±0.00

*：與病毒組比較，P<0.05

組別肺指數(shù)(%)肺指數(shù)抑制率(%)病毒核酸相對(duì)量病毒滴度高劑量組0.81±0.07*38.35±3.910.42±0.06*2.35±0.29*中劑量組0.84±0.10*34.13±2.250.42±0.06*2.43±0.15*低劑量組0.84±0.10*32.26±1.370.65±0.19*2.46±0.12*陽(yáng)性對(duì)照組0.84±0.07*36.36±4.520.37±0.11*2.49±0.12*病毒對(duì)照組1.42±0.12 -1.00±0.062.80±0.16正常組0.77±0.07 - - -F 7.97 17.95 6.64 6.04P 0.03 0.00 0.04 0.04

*：與病毒組比較，P<0.05

3 討論

草血竭是一種使用廣泛的中草藥，蓼科植物的根莖，主要產(chǎn)于云南、貴州、四川三省。其味苦、澀，性溫和，有散血止血，下氣止痛治慢性胃炎，胃、十二指腸潰瘍，食積，癥瘕積聚，月經(jīng)不調(diào)，浮腫，跌打損傷，外傷出血、收斂止瀉之功效[8]。研究發(fā)現(xiàn)，草血竭有鎮(zhèn)痛抗炎作用[9]。另外，有研究報(bào)道草血竭水煮醇沉干浸膏與草血竭純化部分能夠在體外通過(guò)直接滅活作用發(fā)揮抗流感病毒作用[10]。因此，本研究通過(guò)給予甲型H1N1流感病毒感染小鼠不同劑量的草血竭純化部分，觀察其對(duì)小鼠的病死率、肺指數(shù)、肺組織病毒載量、病毒滴度的影響，綜合評(píng)價(jià)草血竭抗病毒效果。

小鼠是目前較為合適的流感感染動(dòng)物模型[11]。同時(shí)呼吸道感染為流感病毒的自然感染方式。在小鼠和雪貂的動(dòng)物模型中，通常采用病毒滴鼻的方法感染動(dòng)物[12]。流感病毒滴鼻感染小鼠，主要引起肺組織單核細(xì)胞浸潤(rùn)，肺重增加，體重減少[13-15]。因此流感病毒感染的小鼠肺指數(shù)高于正常對(duì)照組，說(shuō)明模型構(gòu)建成功。從宏觀上來(lái)看，草血竭純化部分各劑量組可以不同程度地延長(zhǎng)小鼠的平均生存時(shí)間，對(duì)流感感染小鼠具有明確的治療作用。從肺組織的病變上來(lái)看，在草血竭純化部分對(duì)流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)抑制作用研究中，草血竭高、中、低劑量組小鼠的肺指數(shù)均低于病毒對(duì)照組，說(shuō)明草血竭能夠改善流感導(dǎo)致的肺組織病變。從治療機(jī)制上來(lái)看，草血竭純化部分可降低肺組織流感病毒核酸量和病毒的滴度，提示其治療作用是通過(guò)抗病毒實(shí)現(xiàn)的。流感病毒感染后，引起感染細(xì)胞凋亡，機(jī)體炎性細(xì)胞因子、趨化因子等活化：外周血中TNF-a、IL-12、IL-18、IFN-a等表達(dá)上升，NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)目增加，推測(cè)草血竭抗流感病毒的機(jī)制可能與抑制病毒感染引起的組織細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)、增強(qiáng)免疫細(xì)胞的生物學(xué)功能有關(guān)。此外本研究還提示在降低病死率、改善肺組織損傷、抗病毒方面，草血竭中高劑量和經(jīng)典抗流感病毒藥物奧司他韋的效果基本相當(dāng)，表明草血竭在對(duì)流感病毒感染的治療上具有良好的應(yīng)用前景。

綜上所述，草血竭純化部分在體內(nèi)對(duì)甲型H1N1流感病毒具有抑制作用，能夠改善甲型H1N1流感小鼠的肺組織的病變，降低病死率。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kawaoka Y, Neumann G. Influenza virus: an introduction[J]. Methods Mol Biol, 2012, 865: 1-9.

[2] 蔣明彥, 劉國(guó)平, 曾建平, 等.重癥及危重癥甲型H1N1流感患者發(fā)病機(jī)制探討[J].中國(guó)感染控制雜志, 2011, 10(5):326-330.

[3] 謝彬, 王雪峰, 岳志軍, 等.克隆測(cè)序鑒定流感病毒誘導(dǎo)小鼠急性肺炎模型[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志, 2013, 15(2):145-149.

[4] 鄒婷婷, 張智潔, 楊松, 等.流感病毒感染小鼠肺巨噬細(xì)胞Dll1和MHC-Ⅰ表達(dá)研究[J].中國(guó)感染控制雜志, 2014, 13(8):449-453.

[5] 王海, 黃茜華, 彭春梅, 等.實(shí)時(shí)熒光PCR方法在A型流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 6(10):1077-1080.

[6] 黃國(guó)鈞.醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：制作與應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2008.

[7] Jin C, Liang M, Ning J, et al. Pathogenesis of emerging severe fever with thrombocytopenia syndrome virus in C57/BL6 mouse model[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(25): 10053-10058.

[8] 程喬德美,姚默,申萬(wàn)祥, 等.藏藥草血竭的藥學(xué)研究概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(15):8466-8467.

[9] WHO. CDC protocol of real-time RT PCR for influenza A(H1N1)[S]. 2009, 7.

[10] 羅凡, 侯煒, 楊占秋, 等.草血竭抗流感病毒的研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2007, 27(1): 72-74.

[11] 李楓棣, 許黎黎, 鮑琳琳, 等.季節(jié)性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺適應(yīng)株的建立及其分子機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2014, 22(1):22-26.

[12] 劉晨風(fēng), 吳小紅, 趙光宇, 等.人H7N9禽流感病毒、高致病H5N1禽流感病毒及H1N1流感病毒感染小鼠特征分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2014, 22(1):8-12.

[13] Maines TR, Jayaraman A, Belser JA, et al. Transmission and pathogenesis of swine-origin 2009 A (H1N1) influenza viruses in ferrets and mice[J]. Science, 2009, 325(5939): 484-487.

[14] 王成祥, 曹鴻云, 程淼, 等.黃芩、板藍(lán)根等清熱解毒藥對(duì)流感病毒所致肺炎小鼠炎性因子蛋白表達(dá)的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2012, 26(6):415-418.

[15] 王盛美, 揭志軍.中草藥抗流感病毒研究新進(jìn)展[J].國(guó)際呼吸雜志, 2017, 37(10):771-774.