熊瑩暉, 傅永明, 周鵬程, 王曉芳, 黃澤炳, 全 俊, 胡興旺, 范學(xué)工

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 病毒性肝炎湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長(zhǎng)沙 410008)

慢性肝炎持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間可逐漸發(fā)展為肝纖維化、肝硬化及肝癌。慢性肝炎患者的基本病理特征為持續(xù)性肝細(xì)胞損傷，且肝細(xì)胞損傷在疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。損傷的肝細(xì)胞可以根據(jù)受損傷程度的不同而分別進(jìn)入衰老、凋亡或壞死狀態(tài)[1-2]。衰老肝細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞周期阻滯(分子水平表現(xiàn)為細(xì)胞周期阻滯相關(guān)蛋白p53/p21、p16/p-Rb等表達(dá)量升高)、β-半乳糖苷酶(可以區(qū)分衰老細(xì)胞、衰老前細(xì)胞和分化細(xì)胞)表達(dá)、衰老相關(guān)異染色體灶及DNA損傷灶在核內(nèi)聚集等[3]。衰老肝細(xì)胞可分泌大量的細(xì)胞因子(衰老相關(guān)分泌表型)[4-7]，細(xì)胞因子可促進(jìn)炎癥發(fā)生，從而清除衰老、壞死細(xì)胞及惡變細(xì)胞，發(fā)揮修復(fù)機(jī)體損傷的作用[8-9]。肝細(xì)胞長(zhǎng)期受損將導(dǎo)致衰老細(xì)胞積聚，衰老細(xì)胞在組織器官內(nèi)可持續(xù)存活數(shù)年，從而引起組織器官微環(huán)境改變及穩(wěn)態(tài)失衡[10-12]。有研究[13]表明，氧化應(yīng)激、DNA損傷及癌基因的活化等可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、抗凋亡、表觀遺傳改變及衰老相關(guān)分泌表型等的發(fā)生。丙型肝炎病毒感染持續(xù)時(shí)間是導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)展的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素，病史越長(zhǎng)肝纖維化進(jìn)展的可能性越大[14-16]。乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性脂肪肝及非酒精性脂肪肝患者進(jìn)行肝組織活檢時(shí)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞衰老與肝纖維化程度呈正相關(guān)[17-20]。肝臟存在鐵沉積的遺傳性血色素沉著癥患者及肝硬化患者的肝組織標(biāo)本研究顯示存在肝細(xì)胞衰老，且研究者認(rèn)為衰老肝細(xì)胞參與了肝纖維化及肝硬化發(fā)展[21-22]。

在我國(guó)，乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起慢性肝病的首要病因，約有90%的肝細(xì)胞癌是由慢性肝病發(fā)展而來(lái)[23]。因此，研究慢性乙型肝炎疾病發(fā)展的誘因和機(jī)制具有重要的臨床指導(dǎo)意義。有研究[17]發(fā)現(xiàn)HBV慢性感染可誘發(fā)肝細(xì)胞衰老，但HBV誘發(fā)肝細(xì)胞衰老的機(jī)制尚不清楚。有研究[24]表明HBV編碼的X蛋白(HBx)可促進(jìn)外泌體分泌，并可通過(guò)外泌體或肝星狀細(xì)胞上調(diào)纖維化重要標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。另外，在過(guò)表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞皮下成瘤的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中膠原纖維Ⅰ和Ⅳ的含量上升，因此，研究者認(rèn)為HBx參與了肝纖維化的發(fā)展[25]。HBx已經(jīng)被確認(rèn)屬于癌基因，癌基因的激活可誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老[13]?；谝陨涎芯浚覀兺茰y(cè)HBx可能參與HBV誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老的過(guò)程，并通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HBx參與HBV誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老，具體結(jié)果闡述如下。

1 材料與方法

1.1 研究細(xì)胞和試劑 HepG2.2.15 細(xì)胞購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，HepG2 細(xì)胞和293T細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)；抗體p21(2947s)和p16(14256)購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；抗體p53(sc-53395)購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司；Senescence β-Galactosidase Staining Kit(貨號(hào)：C0602)購(gòu)于碧云天公司；DharmaFECT 1 Transfection Reagent(T-2001-03)購(gòu)于Dharmacon公司；pLV-EF1α-MCS-IRES-Bsd(cDNA-pLV03)購(gòu)于Biosettia公司；HBx si-RNA(正義鏈5’-UCACCUCUGCACGUAGCAUTT-3’，反義鏈5’-AUGCUACGUGCAGAGGUGATT-3’)購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)公司，BCA Protein Assay Kit(1859078)以及ECL(34095)購(gòu)于Thermo Scientific Pierce Protein Biology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 構(gòu)建HBx過(guò)表達(dá)慢病毒 將293T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)，將PLVX-HBx過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒(pMDLg/pRRE，pRSV-REV，pCMV-VSV-G)混合于500 μL無(wú)血清DMEM中(混合比例為pLVXsh∶pMDLg/pRRE∶pRSV-REV∶pCMV-VSV-G=1.5∶1∶0.75∶0.3∶0.45)；另外，取7.5 μL lipofectamine 2000 加入500 μL無(wú)血清DMEM后混勻，靜置5 min；然后將兩種DMEM混合物合并混勻，靜置15 min。將混合后的DMEM加入無(wú)抗生素完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染12 h后換液，然后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液上清，在1 300 rmp下離心5 min去除細(xì)胞碎片，獲得含慢病毒的培養(yǎng)液上清。對(duì)照組為未進(jìn)行HBx過(guò)表達(dá)慢病毒，采用相同的操作方法獲對(duì)照組未進(jìn)行HBx過(guò)表達(dá)慢病毒上清培養(yǎng)液。

1.2.2 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞系(HepG2-HBx)及其對(duì)照組細(xì)胞系(HepG2-HBx-con) 將HepG2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞融合度為20%～30%左右時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入2 mL含有200 μL HBx過(guò)表達(dá)慢病毒液和4 μg/mL的polybrane無(wú)抗生素完全培養(yǎng)基，然后加入慢病毒液感染HepG2細(xì)胞，在1 000 g下離心1 h。HepG2細(xì)胞感染24 h后換新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后用含殺稻瘟菌素(6 μg/μL)的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，篩選一個(gè)月左右得到穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞系(HepG2-HBx)。同時(shí)用未進(jìn)行HBx過(guò)表達(dá)慢病毒采用相同的操作方法獲得對(duì)照組細(xì)胞系(HepG2-HBx-con)。

1.2.3 構(gòu)建瞬時(shí)沉默HBx蛋白的HepG2.2.15細(xì)胞(HepG2.2.15-HBx-si)及其對(duì)照組細(xì)胞(HepG2.2.15-HBx-nc) 將HepG 2.2.15細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在細(xì)胞融合度達(dá)到40%左右時(shí)，將5 μmol HBx si-RNA或5 μmol HBx nc si-RNA混于500 μL無(wú)血清DMEM中；另外，取5 μL DharmaFECT 1 Transfection Reagent與500 μL無(wú)血清DMEM進(jìn)行混勻，靜置5 min；然后將兩種DMEM混合物合并混勻，靜置15 min；取DMEM混合物加入無(wú)抗生素完全培養(yǎng)基的HepG2.2.15細(xì)胞中，構(gòu)建HepG2.2.15-HBx-si 和HepG2.2.15-HBx-nc。72 h后可提取細(xì)胞蛋白。

1.2.4 衰老細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色 衰老細(xì)胞內(nèi)表達(dá)β-半乳糖苷酶在pH6.0時(shí)具有高酶活性，在經(jīng)Senescence β-Galactosidase Staining Kit處理的衰老細(xì)胞中，該酶可催化試劑底物產(chǎn)生一種深藍(lán)色物質(zhì)，使細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)深藍(lán)色。首先接種1.0×105/孔的細(xì)胞于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用1 mL PBS洗1次，加入0.5 mL β-半乳糖苷酶染色固定，室溫靜置15 min；吸去固定液后用1 mL PBS洗3次，每次洗3 min；吸去PBS后每孔加入0.5 mL染色工作液(染色工作液配方：A液5 μL、B液5 μL、C液465 μL)，37 ℃孵育過(guò)夜；采用PBS洗1次后于顯微鏡下觀察染色狀態(tài)，并進(jìn)行拍照；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白 應(yīng)用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞衰老相關(guān)分子p21、p16等的表達(dá)量。首先提取經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞總蛋白，用BCA Protein Assay Kit測(cè)量蛋白濃度后，采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后用TBST緩沖液洗3次，每次5 min；隨后加一抗(1∶1 000 TBST稀釋)4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗3遍，每次5 min。加入對(duì)應(yīng)二抗(1∶2 000 TBST稀釋)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗3遍，每次10 min，加ECL發(fā)光液后觀察結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 HepG2.2.15細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色 HepG2.2.15(含有HBV全基因組的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系)中的β-半乳糖苷酶著色較HepG2細(xì)胞明顯增強(qiáng)，見(jiàn)圖1。每個(gè)組選取多個(gè)不重復(fù)獨(dú)立視野，進(jìn)行染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞所占比例HepG2.2.15組(0.480±0.096)高于HepG2組(0.016±0.005)，且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖2。

HepG2 HepG2.2.15

圖1HepG2衰老細(xì)胞(n=3)和HepG2.2.15衰老細(xì)胞(n=3)β-半乳糖苷酶染色圖

Figure1Senescence β-galactosidase staining of HepG2 (n=3) and HepG2.2.15 (n=3)

圖2HepG2衰老細(xì)胞(n=3)和 HepG2.2.15衰老細(xì)胞(n=3)β-半乳糖苷酶染色比較

Figure2Comparison of senescence β-galactosidase staining between HepG2 (n=3) and HepG2.2.15 (n=3)

2.2 HepG2.2.15細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p53與p21表達(dá)情況 采用細(xì)胞蛋白tublin作為內(nèi)參進(jìn)行比較，HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞周期阻滯的蛋白p53和p21的表達(dá)水平高于HepG2組，HepG2.2.15細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p53與p21表達(dá)量較HepG2顯著上調(diào)，HBx在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在HepG2內(nèi)無(wú)表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖3 HepG2.2.15細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白表達(dá)(n=3)

Figure3Expression level of senescence-associated protein in HepG2.2.15 (n=3)

2.3 HBx沉默的HepG2.2.15細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色 HepG2.2.15-HBx-si組β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞比例較其對(duì)照組(HepG2.2.15-HBx-nc)有所下降。HBx沉默后HepG2.2.15行β-半乳糖苷酶染色后發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞HepG2.2.15-HBx-si比例為(0.278±0.065)，對(duì)照組HepG2.2.15-HBx-nc為(0.329±0.044)，兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.092)。見(jiàn)圖4、圖5。

HepG2.2.15-HBx-nc HepG2.2.15-HBx-si

圖4HBx沉默(n=3)和HBx未沉默(n=3)HepG2.2.15細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色圖

Figure4Senescence β-galactosidase staining in HepG2.2.15-HBx-si (n=3) and HepG2.2.15-HBx-nc (n=3)

2.4 HepG2.2.15細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白表達(dá)情況 采用細(xì)胞蛋白tublin作為內(nèi)參進(jìn)行比較，HBx沉默處理后的HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBx蛋白水平較其對(duì)照組HepG2.2.15-HBx-nc下降，HBx沉默的HepG2.2.15細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p53與p21表達(dá)量較HepG2.2.15下調(diào)。見(jiàn)圖6。

圖5HBx沉默(n=3)與HBx未沉默(n=3)的HepG2.2.15細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色比較

Figure5Comparison of senescence β-galactosidase staining between HepG2.2.15-HBx-si(n=3) and HepG2.2.15-HBx-nc(n=3)

圖6 HepG2.2.15細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白表達(dá)量(n=3)

Figure6Expression level of senescence-associated protein in HepG2.2.15 (n=3)

2.5 HBx過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色 β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞比例HepG2-HBx組為(0.319±0.033)，對(duì)照組HepG2-HBx-con為(0.064±0.012)，兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；HepG2-HBx β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞比例高于對(duì)照組。見(jiàn)圖7、圖8。

HepG2-HBx-con HepG2-HBx

圖7HBx過(guò)表達(dá)對(duì)照組和HBx過(guò)表達(dá)組HepG2衰老細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色圖

Figure7Senescence β-galactosidase staining of HepG2-HBx-con and HepG2-HBx

圖8HBx過(guò)表達(dá)對(duì)照組(n=3)和HBx過(guò)表達(dá)組(n=3)HepG2衰老細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色比較

Figure8Comparison of senescence β-galactosidase staining between HepG2-HBx-con and HepG2-HBx

2.6 HBx過(guò)表達(dá)HepG2細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白分子表達(dá)情況 采用細(xì)胞蛋白tublin作為內(nèi)參進(jìn)行比較，HBx在HepG2-HBx細(xì)胞中表達(dá)，而HepG2-HBx-con內(nèi)無(wú)表達(dá)；HBx過(guò)表達(dá)HepG2-HBx細(xì)胞內(nèi)周期阻滯相關(guān)蛋白p53和p21的表達(dá)量高于不表達(dá)HBx的HepG2-HBx-con細(xì)胞。見(jiàn)圖9。

圖9HBx過(guò)表達(dá)HepG2衰老細(xì)胞相關(guān)蛋白分子表達(dá)量(n=3)

Figure9Expression level of senescence-associated protein in HepG2-HBx (n=3)

3 討論

HBV感染是一個(gè)世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題，全世界范圍內(nèi)約有3.5億慢性感染患者[26]。我國(guó)HBV感染的情況更為嚴(yán)重，2006年全國(guó)乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查表明，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶率為7.18%，每年因HBV所致的肝硬化、肝癌死亡病例約有30萬(wàn)[27]。因此，乙型肝炎發(fā)病機(jī)制研究具有重要意義。

慢性乙型肝炎患者肝臟活檢研究顯示，HBV感染患者肝細(xì)胞存在衰老現(xiàn)象，衰老細(xì)胞將出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯[17, 28]。本研究結(jié)果顯示穩(wěn)轉(zhuǎn)HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞中的衰老細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞的比例高于對(duì)照組HepG2細(xì)胞，且在衰老細(xì)胞周期阻滯中起重要調(diào)控作用的p53蛋白及其下游分子p21表達(dá)量也較HepG2細(xì)胞高，說(shuō)明HepG2.2.15細(xì)胞中衰老相關(guān)蛋白激活，HBV誘發(fā)了肝細(xì)胞衰老。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步探討HBV通過(guò)何種方式促使肝細(xì)胞衰老，發(fā)現(xiàn) HBx在慢性乙型肝炎的疾病發(fā)展中發(fā)揮重要作用[24-25]，但是，具體機(jī)制尚不清楚。因此，我們猜想HBV可以通過(guò)其編碼的HBx誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老。本研究通過(guò)在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)沉默HBx后行β-半乳糖苷酶染色，發(fā)現(xiàn)雖然衰老細(xì)胞比例的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但整體而言在沉默HBx后衰老細(xì)胞減少，且周期阻滯蛋白p53和p21的表達(dá)水平下降，說(shuō)明細(xì)胞周期阻滯減弱，提示HBx在HBV誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老中起到調(diào)控作用，可促進(jìn)肝細(xì)胞衰老。本研究在HepG2細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)HBx，發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞染色明顯增強(qiáng)，p53和p21蛋白表達(dá)量亦上調(diào)，表明在HepG2內(nèi)過(guò)表達(dá)HBx可激活細(xì)胞內(nèi)衰老相關(guān)蛋白。以上研究驗(yàn)證了HBV可通過(guò)HBx促進(jìn)肝細(xì)胞衰老。

衰老細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8等，這些炎癥因子可激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)肝臟的損傷修復(fù)[6，29]。但是，長(zhǎng)期持續(xù)性損傷可導(dǎo)致衰老細(xì)胞長(zhǎng)期存在，不斷釋放細(xì)胞因子引起肝纖維化，甚至可進(jìn)展為肝硬化。在我國(guó)慢性肝病患者中，HBV感染引起肝持續(xù)性損傷的慢性肝炎最為常見(jiàn)。慢性乙型肝炎可以進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化，最后或可發(fā)展為肝癌。HBV通過(guò)HBx誘導(dǎo)的肝細(xì)胞衰老可能在整個(gè)疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，為我們認(rèn)識(shí)乙型肝炎相關(guān)性肝疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的思路，或可為將來(lái)慢性肝病的治療提供新的方向。

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