謝 昆, 李湘燕, 朱賽楠, 齊 心, 鄭 波

(北京大學第一醫(yī)院，北京 100034)

中重度皮膚軟組織感染(skin and soft tissue infection,SSTI)早期使用敏感抗菌藥物，對控制病情、縮短病程都有重要的臨床意義[1]。目前SSTI治療方案的制定主要根據(jù)常規(guī)細菌培養(yǎng)結(jié)果，但是常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果相對滯后、陽性率低，導致患者可能錯失抗感染治療的黃金時期，因此，病原學的早期診斷，對實現(xiàn)早期抗菌藥物目標性治療，改善患者預后有重要意義[2]。分子診斷技術(shù)是應用分子生物學方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)而做出診斷的技術(shù)，檢測靶標包括DNA、RNA，是當前醫(yī)學發(fā)展的重要前沿領(lǐng)域之一。分子診斷技術(shù)的主要手段包括聚合酶鏈式反應技術(shù)、基因芯片技術(shù)及DNA測序等。聚合酶鏈反應技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR)作為分子生物學方法中一種常用的方法，以其敏感、特異、簡便、快速的特點，可用于感染早期快速檢測，并明確病原體[3]。然而目前分子病原學診斷多用于創(chuàng)面分泌物的檢測，缺乏SSTI病變組織的研究。本研究旨在評估中重度SSTI組織樣本中分子生物學檢測方法的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 按照連續(xù)采樣方法，收集2016年1—10月北京大學第一醫(yī)院整形燒傷外科收治的中重度SSTI病例。入組標準：符合美國感染病學會(Infectious Diseases Society of America)中重度SSTI的分級標準[4]。入組患者50例，其中糖尿病足并感染患者22例，手術(shù)部位感染患者15例，膿腫患者8例，壞死性筋膜炎患者5例。

1.2 標本留取及處理 創(chuàng)面徹底清創(chuàng)后，使用4 mm 環(huán)鉆取深部組織共3塊，加入30 mL生理鹽水，研磨后，制成懸濁液后平均分為3份。第1份注入帶有培養(yǎng)基的需氧及厭氧培養(yǎng)瓶內(nèi)，常規(guī)細菌培養(yǎng)。第2份行細菌涂片檢查，細菌涂片及培養(yǎng)由北京大學第一醫(yī)院檢驗科細菌室完成。第3份使用DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3 主要試劑及儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技(北京)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；TaKaRa Taq Hot Start Version、2.5 mmol dNTP Mixture、10×PCR Buffer均購自寶生物工程(大連)有限公司；親和素堿性磷酸酶購自Vector公司；牛血清白蛋白、BCIP、NBT購自Amresco公司；Biotin-11-dUTP購自紅惠新醫(yī)藥公司；其他生化試劑購自北京化工廠；硝酸纖維素膜購自GE公司。PCR儀為美國賽默飛世爾公司的ABI 9700 I 型PCR儀；AH-8100生物芯片雜交儀、AH-8200生物芯片雜交儀、AA-9100生物芯片分析儀為和利時公司產(chǎn)品。

1.4 引物設計 以金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌等九種常見細菌基因組保守區(qū)為靶序列，自行設計特異性引物及試劑盒，對標本的DNA行PCR檢測，引物序列見表1。

1.5 分子檢測 PCR擴增：PCR反應體系1為：1×PCR Buffer，2 μmol dNTP，4 μmol Biotin-11-dUTP，2 mmol MgCl2，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌、糞腸球菌上下游引物各400 nmol ，2 U Taq酶，0.4 U JNG酶，模板2 μL，水加至60 μL；PCR反應體系2為：1×PCR Buffer，2 μmol dNTP，4 μmol Biotin-11-dUTP，2 mmol MgCl2，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌上下游引物各400 nmol ，2 U Taq酶，0.4 U JNG酶，模板2 μL，水加至60 μL。反應條件：37℃消化10 min；94℃預變性4 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。 探針標記及雜交：將9條特異性探針標記于硝酸纖維素膜上，每條探針標記3個點。將PCR擴增后的反應管置于PCR擴增儀中99℃，10 min，然后快速置于冰水浴中。設置雜交程序按照儀器說明書[5]。將雜交反應后的芯片放入生物芯片分析儀中進行數(shù)據(jù)分析，判讀結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計方法 應用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，采用描述性統(tǒng)計方法。

2 結(jié)果

2.1 革蘭染色結(jié)果 革蘭染色方法陽性率為16.0%(8/50)，其中革蘭陽性球菌4份，革蘭陰性桿菌1份，陰性桿菌合并陽性球菌2份，陰性桿菌合并陽性桿菌1份。

表1 各菌種的特異性引物序列及特異性探針序列

2.2 常規(guī)細菌培養(yǎng)與分子生物學檢測結(jié)果 常規(guī)細菌培養(yǎng)方法陽性率為76.0%(38/50)，其中單一菌種35份，多菌種3份，分別為大腸埃希菌合并糞腸球菌2份，金黃色葡萄球菌合并糞腸球菌1份。其中有2份培養(yǎng)陽性標本考慮為非致病菌，菌種分別為藤黃微球菌及痤瘡丙酸桿菌。分子檢測陽性率56.0%(28/50)，單一菌種22份，多菌種6份。詳見表2、表3。

表2 常規(guī)培養(yǎng)與分子生物學檢測結(jié)果(n=50)

表3常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測結(jié)果菌種分布(株)

Table3Distribution of strain species of routine culture and molecular detection results (No. of isolates)

細菌常規(guī)培養(yǎng)分子檢測金黃色葡萄球菌1014大腸埃希菌46表皮葡萄球菌42糞腸球菌45銅綠假單胞菌34陰溝腸桿菌33肺炎克雷伯菌22白假絲酵母菌3-變形桿菌屬3-鏈球菌屬2-雷丁放線菌1-藤黃微球菌1-痤瘡丙酸桿菌1-合計4136

2.3 培養(yǎng)法和分子檢測法檢測結(jié)果比較 除去常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果不在選取的9種細菌范圍內(nèi)的標本11份，納入統(tǒng)計的共 39份標本。其中細菌涂片陽性者8份，陽性率為20.5%；常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測結(jié)果陽性率均為69.2 %(27/39)。常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測結(jié)果完全符合率為82.1%(32/39)：二者結(jié)果均為陰性占25.6%(10/39)；二者結(jié)果均為陽性且完全符合占56.4%(22/39)。常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測結(jié)果不符合率為17.9%(7/39)，分子檢測結(jié)果為多種細菌，而培養(yǎng)結(jié)果為單一細菌者占7.7%(3/39)；分子檢測結(jié)果為陽性而培養(yǎng)結(jié)果為陰性者占5.1%(2/39)。詳見表4。

表4常規(guī)培養(yǎng)法和分子檢測法結(jié)果比較(份)

Table4Comparison of routine culture and molecular detection results (No. of specimens)

檢測結(jié)果常規(guī)培養(yǎng)分子檢測符合單一菌種 金黃色葡萄球菌9109 肺炎克雷伯菌222 大腸埃希菌232 銅綠假單胞菌322 糞腸球菌111 陰溝腸桿菌311 表皮葡萄球菌422多菌種 大腸埃希菌+糞腸球菌222 金黃色葡萄球菌+糞腸球菌111 銅綠假單胞菌+金黃色葡萄球菌010 金黃色葡萄球菌+陰溝腸桿菌+糞腸球菌010 銅綠假單胞菌+陰溝腸桿菌+大腸埃希菌010合計272722

3 討論

中重度SSTI，尤其是有膿毒癥的患者，早期使用敏感的抗菌藥物控制感染，對控制病情、縮短病程都有重要的臨床意義[6]。早期病原學的診斷有助于在感染早期實現(xiàn)目標性治療，避免抗菌藥物的濫用，以達到進行個性化精準治療的目的[7-8]。分子檢測技術(shù)可以通過在分子生物學水平上研究生物大分子，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分檢測無法培養(yǎng)或難以鑒定的病原性微生物[9-10]。對于單一致病菌導致的感染檢測有著非常好的效果，已經(jīng)廣泛應用于HIV、HCV等多種病毒感染以及衣原體及分枝桿菌感染的檢測中[11-13]。目前已有報道稱多重PCR-基因芯片雜交技術(shù)可用于耐藥菌感染的病原學早期診斷和耐藥基因的同步檢測[14-15]。但目前尚無分子診斷方法用于中重度SSTI的快速檢測產(chǎn)品問世，急需開展相關(guān)研究。

根據(jù)我院近5年來軟組織感染的細菌譜，并結(jié)合其他學者的研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌等9種細菌是臨床軟組織感染最常見的病原體，合計占全部病原體的90%以上[16]。故我們在實驗中選取這9種細菌，展開相關(guān)分子病原學研究。我們選取的50例患者中，常規(guī)培養(yǎng)陽性共38例，而這9種細菌共27例，僅占71.1%，說明這9種細菌雖然可以覆蓋大部分的常見致病菌，但仍存在覆蓋不足的問題，后期研究應擴大分子病原學研究的菌種范圍。

涂片的敏感性較低，低于常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測，不宜作為早期病原體鑒定的可靠檢查方法，僅可以作為補充檢測手段。雖然目前常規(guī)培養(yǎng)是感染診斷的金標準，但其本身仍具有很大的缺陷，包括標本采集情況、培養(yǎng)條件的選擇及不同種細菌直接的互相影響等，并不總能真實的反映感染病原體的情況。在實驗中為了提高陽性率，雖然我們采用了取組織塊研磨培養(yǎng)等方法，但是總體的培養(yǎng)陽性率并不高，僅為76.0%，可能還需要進一步改善取材方法及檢驗方法。最終入組進行對比研究的39例患者中，分子檢測與常規(guī)培養(yǎng)的陽性率大致相當，二者的完全符合率為82.1%，具有較高的符合程度。部分符合率7.7%，均為分子檢測結(jié)果為多種細菌感染，而培養(yǎng)結(jié)果僅為單一細菌，說明對于復雜的復合菌感染的病原學診斷，分子檢測手段具有一定的優(yōu)勢。

比較實驗中常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測兩種檢測方法結(jié)果的差異，主要有三類情況：首先，分子檢測結(jié)果為多種細菌感染，而培養(yǎng)結(jié)果僅為單一細菌者 3 例。其原因可能為在復合菌感染的情況下，常規(guī)培養(yǎng)時，不同細菌相互之間有抑制作用，不能形成優(yōu)勢菌群生長，而分子檢測并不受這種因素的影響，只要標本中存在細菌核酸，即能檢測出對應細菌。其次，分子檢測結(jié)果為陽性而培養(yǎng)結(jié)果為陰性者 2 例，細菌分別為大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌，以上兩種差異體現(xiàn)了分子檢測方法對常見致病菌和復合菌感染敏感性高于普通細菌培養(yǎng)。第三，分子檢測結(jié)果為陰性而培養(yǎng)結(jié)果為陽性者 2 例，細菌均為表皮葡萄球菌，因為表皮葡萄球菌為正常定植菌，廣泛存在于自然界中，不除外取材或轉(zhuǎn)移過程中有污染可能，從而導致的假陽性出現(xiàn)，但也不能除外是由本研究中分子檢測手段的缺陷導致的假陰性可能，需要增加樣本量后進一步評估。

綜上所述，本研究顯示分子檢測技術(shù)與常規(guī)培養(yǎng)等方法相比較具有很高的一致性，在復合菌感染檢出方面有一定的優(yōu)勢。

[參考文獻]

[1] McClain SL, Bohan JG, Stevens DL. Advances in the medical management of skin and soft tissue infections[J]. BMJ, 2016, 355: i6004.

[2] Walsh TL, Chan L, Konopka CI, et al. Appropriateness of antibiotic management of uncomplicated skin and soft tissue infections in hospitalized adult patients[J]. BMC Infect Dis, 2016, 16(1): 721.

[3] Tuttle MS, Mostow E, Mukherjee P, et al. Characterization of bacterial communities in venous insufficiency wounds by use of conventional culture and molecular diagnostic methods[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(11): 3812-3819.

[4] Stevens DL, Bisno AL, Chambers HF, et al. Practice guidelines for the diagnosis and management of skin and soft tissue infections: 2014 update by the Infectious Diseases Society of America[J]. Clin Infect Dis, 2014, 59(2): e10-e52.

[5] Singh A, Goering RV, Simiee S. Application of molecular techniques to the study of hospital infection[J]．Clin Microbiol Rev, 2006, l9(3): 512-530.

[6] Stevens DL, Bisno AL, Chambers HF, et al. Practice guidelines for the diagnosis and management of skin and soft-tissue infections[J]. Clin Infect Dis, 2005, 41(10): 1373-1406.

[7] Burnham JP, Kirby JP, Kollef MH. Diagnosis and management of skin and soft tissue infections in the intensive care unit: a review[J]. Intensive Care Med, 2016, 42(12): 1899-1911.

[8] Putnam LR, Richards MK, Sandvall BK, et al. Laboratory evaluation for pediatric patients with suspected necrotizing soft tissue infections: a case-control study[J]. J Pediatr Surg, 2016, 51(6): 1022-1025.

[9] Pruesse E, Quast C, Knittel K, et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB[J]. Nucleic Acids Res, 2007, 35(21): 7188-7196.

[10] Gallo PH, Melton-Kreft R, Nistico L, et al. Demonstration ofBacilluscereusin orthopaedic-implant-related infection with use of a multi-primer polymerase chain reaction-mass spectrometric assay: report of two cases[J]. J Bone Joint Surg Am, 2011, 93(15): e85.

[11] Assih M, Feteke L, Bisseye C, et al. Molecular diagnosis of the human immunodeficiency, hepatitis B and C viruses among blood donors in Lomé (Togo) by multiplex real time PCR[J]. Pan Afr Med J, 2016, 25: 242.

[12] Yang L, Li M, Du F, et al. A Novel Colorimetric PCR-based biosensor for detection and quantification of hepatitis B virus[J]. Methods Mol Biol, 2017, 1571: 357-369.

[13] Rudkj?bing VB, Thomsen TR, Xu Y, et al. Comparing culture and molecular methods for the identification of microorganisms involved in necrotizing soft tissue infections[J]. BMC Infect Dis, 2016, 16(1): 652.

[14] Rhoads DD, Wolcott RD, Sun Y, et al. Comparison of culture and molecular identification of bacteria in chronic wounds[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13(3): 2535-2550.

[15] Rudkj?bing VB, Aanaes K, Wolff TY, et al. An exploratory study of microbial diversity in sinus infections of cystic fibrosis patients by molecular methods[J]. J Cyst Fibros, 2014, 13(6): 645-652.

[16] 侯芳, 李耘, 李湘燕.衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)2010年門診來源細菌耐藥監(jiān)測[J].中國臨床藥理學雜志, 2011, 27(12):899-904, 912.