朱澤華, 鄒明祥, 張現(xiàn)忠, 胡 碩

(1 中南大學湘雅醫(yī)院, 湖南 長沙 410008; 2 廈門大學分子影像中心, 福建 廈門 361102)

急性胰腺炎是臨床常見的一種急腹癥，大部分為自限性(約80%)，但也有部分患者(約20%)可發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)，這與延長患者住院時間關系密切[1-2]。SAP患者更易發(fā)生繼發(fā)感染，一旦發(fā)生感染，患者病情明顯加重，病死率升高。研究[3-5]表明，目前，引起患者繼發(fā)感染的病原體，革蘭陰性菌以腸桿菌科細菌為主(18.4%～23.4%)；而革蘭陽性菌則以金黃色葡萄球菌為主。引起繼發(fā)感染發(fā)生的具體機制尚不明確，經(jīng)內源性途徑感染細菌，如經(jīng)周圍臟器膽道及十二指腸進入胰腺的“細菌易位學說”，目前已經(jīng)被廣泛認可[6]。感染發(fā)生早期臨床上常規(guī)診斷感染的手段(如血常規(guī)、細菌培養(yǎng))得到結果的時間往往要滯后于疾病進展；傳統(tǒng)的影像學方法，如CT和MRI在急性胰腺炎早期診斷中有重要價值，但不具備檢測感染的功能；穿刺液細菌培養(yǎng)作為診斷繼發(fā)感染灶的“金標準”，有些病灶位置過深不能穿刺直接影響檢測結果[7-8]。探索無創(chuàng)而特異的早期診斷感染的方法，對SAP繼發(fā)感染給予及時治療，降低患者病死率都將有極大的價值。本研究擬探討氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描/計算機斷層掃描(18F-FDG PET/CT)顯像早期特異性診斷SAP繼發(fā)感染的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本實驗研究動物統(tǒng)一由中南大學實驗動物中心提供，共有15只8～12 W的SD大鼠，均為雄性，體重250～350 g。動物實驗遵循中南大學實驗動物中心規(guī)定并通過中南大學湘雅醫(yī)院倫理委員會的審核。細菌ATCC 25922和ATCC 25923作為研究菌株，購自上海復祥生物有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動物和細菌制備 實驗大鼠在中南大學實驗動物中心飼養(yǎng)1 W后開始進行實驗；實驗前禁食10 h，禁水4 h。復蘇細菌后將其接種于平板，然后從平板上挑取單個菌落加入到LB培養(yǎng)液中(5 mL/管)，在溫箱內以35℃、220 rpm震蕩過夜；再分別取100 μL活化液，加入5 mL LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)3 h。在酶標儀下測定菌液OD625nm，OD在0.5～0.8，此時的細菌濃度約為108/mL；分別取4 mL菌液，在5 500 rpm條件下離心8 min，吸掉上清，再用生理鹽水稀釋10倍，得到107/mL的ATCC 25922和ATCC 25923標準菌株懸浮液。

1.2.2 細菌攝取18F-FDG實驗 按照上一步培養(yǎng)方法配制從108/mL到105/mL共計4個濃度梯度的標準菌株懸浮液，并以0作為起始濃度，每管內1 mL菌懸液，每個濃度分裝3管。分別在每管菌懸液內加入18F-FDG 20 kBq/mL，在35℃水浴箱孵育2 h后離心棄掉上清，并用4℃PBS緩沖液清洗3遍。最后用gama計數(shù)儀(WIZARD2 2480)進行放射性計數(shù)，測定加入18F-FDG菌懸液和標準菌懸液的放射強度。

1.2.3 動物模型制備 首先將15只SD大鼠編號后隨機分為三組，分別為革蘭陽性菌組、革蘭陰性菌組和生理鹽水組，每組各5只。在SD大鼠腹腔內注射3 mL/kg的10%水合氯醛進行麻醉，麻醉后在恒溫超凈手術臺(35℃)進行操作。備皮消毒后在腹部正中劍突下切開，切口長1～1.5 cm，切開后推開表面腸管，探查到胃及幽門，提起幽門，暴露十二指腸，向下順序探查約5 cm，可見環(huán)形狹窄的乳頭部，暴露充分后，發(fā)現(xiàn)十二指腸乳頭開口隱匿于腸壁；用生理鹽水滴淋乳頭區(qū)域，觀察胰腺呈淡粉紅偏白色、未見積液；順著胰膽管向上，探查到肝門處(數(shù)條主胰管匯集)，用小血管夾(1.5 cm)夾閉近肝門側；在乳頭對側用靜脈留置針穿刺滑行進入膽胰管，深度約1～2 cm，用另一只血管夾夾閉乳頭部，后退金屬針芯。靜脈留置針連接微量注射泵，恒速(6 mL/h)泵入3.6%牛磺膽酸鈉(1 mL/kg)；輸注結束后拔除靜脈留置針，繼續(xù)夾閉3～5 min。所有大鼠輸注牛磺膽酸鈉后，以相同方法相同速度注入107/mL細菌懸浮液/生理鹽水，繼續(xù)夾閉3～5 min。操作完成后可見胰腺出現(xiàn)水腫，且胰腺顏色由粉紅色變?yōu)榘迭S色，最后變?yōu)楹谏つ[脹明顯，周圍有明顯滲出物。手術完成后，所有大鼠禁食禁水，且每只大鼠給予皮下補液2 mL。

1.2.4 血生化檢測 所有大鼠分別在手術后0、1、3 h取全血及血清，測定血清淀粉酶濃度和全血細胞計數(shù)。

1.2.5 PET/CT掃描及半定量分析 構建動物模型3 h后給予靜脈注射18F-FDG 300 UCi/100g，靜脈注射后1 h，采用小動物活體成像系統(tǒng)(Siemense Inveon PET/CT)進行多床位顯像。掃描參量：電壓80 kV，電流50 mA，F(xiàn)ilter 0.5 cm。靜態(tài)掃描過程中，采用恒溫氣體泵入動物倉進行保溫。每只大鼠于矢狀位圖上，根據(jù)放射性濃聚范圍勾畫感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，并使用MicroPET自帶的配套軟件系統(tǒng)(Inveon Research Workplace 4.1)進行數(shù)據(jù)處理。本實驗以肌肉組織作為對照，ROI放射性計數(shù)與肌肉放射性計數(shù)之比(攝取比)作為評價標準。

1.2.6 病理和微生物檢驗 掃描完成后處死大鼠選取完整胰腺組織，肉眼觀察胰腺改變，并且切取部分壞死感染灶，勻漿后做細菌LB培養(yǎng)基涂片和培養(yǎng)。感染灶組織進行HE染色和Gram染色后，顯微鏡下觀察病理改變和微生物學結果。SAP繼發(fā)感染診斷標準：HE染色經(jīng)典評分≥8分，并且細菌培養(yǎng)陽性，Gram染色發(fā)現(xiàn)病原微生物。所有標本均由三位有經(jīng)驗的病理檢驗醫(yī)生在未知實驗分組的情況下進行獨立判斷。

1.2.7 生物學分布 PET/CT掃描完成后當即處死實驗動物，盡量分離出完整的器官組織，包括腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、肌肉、骨骼、小腸、血液、胰腺及生殖腺等共計13個。分別測量器官組織重量(合計重量減去已經(jīng)測量的樣品管重量)，依照統(tǒng)一順序放入全自動伽馬計數(shù)儀(WIZARD2 2480)進行測量。測量完成后，儀器自動進行衰減矯正后，計算每個器官和組織的每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。

2 結果

2.1 細菌攝取18F-FDG實驗在細菌濃度達到106CFU/mL時，攝取開始明顯增加。滅活的細菌吸收率為0，ATCC 25923比ATCC 25922吸收率略高，且兩者均未達到飽和狀態(tài)(飽和濃度>108CFU/mL)。見圖1。

圖1 細菌攝取18F-FDG實驗

2.2 生化檢測指標 15例樣本中僅有4例大鼠全血細胞計數(shù)中白細胞計數(shù)較基線升高(金黃色葡萄球菌組2例，其余兩組各1例)，三組間白細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。全部樣本血清淀粉酶基線為(318.315±145.118)U/L，15只大鼠血清淀粉酶均于建模后升高[1 h:(1 343.081±30.120) U/L；3 h:(3 472.925±689.834) U/L]。三組大鼠血清淀粉酶差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 病理改變和微生物檢測結果

2.3.1 病理改變 三組大鼠感染灶HE染色后均見胰腺結構混亂，組織間隙顯著增寬，腺體結構破壞明顯，細胞壞死溶解，呈廣泛液化性壞死，細胞質內可見伊紅均染的無結構物質。間質內血管充血明顯，可見彌漫紅細胞浸潤，并伴有廣泛的中性粒細胞(膿細胞)浸潤(400倍)，三組病理改變評分均高于8分，差異無統(tǒng)計學意義(F=1.81，P=0.21)。見圖2。

A：大腸埃希菌組；B：金黃色葡萄球菌組；C：生理鹽水組

2.3.2 微生物檢測結果 Gram染色后顯微鏡下可見感染灶中央呈明顯的液化性壞死，腺體結構消失，脂肪細胞內為均染的無結構物質或空泡。大腸埃希菌組感染灶內可見短桿狀陰性細菌，金黃色葡萄球菌組可見圓球形聚集成團的陽性菌，生理鹽水組未發(fā)現(xiàn)明顯的細菌定植征象，見圖3。

2.4 PET/CT掃描 PET/CT掃描后顯示三組大鼠胰腺部位均可見放射性特異性聚集，大腸埃希菌組和金黃色葡萄球菌組，放射性特異性聚集更為顯著，見圖4。PET/CT定量結果顯示大腸埃希菌組、金黃色葡萄球菌組和生理鹽水組靶(胰腺)與非靶(肌肉)比值分別為4.22±0.61、4.32±1.21和2.26±0.35，大腸埃希菌組和金黃色葡萄球菌組靶與非靶比值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩個細菌感染組與對照組分別比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。見圖5。

A：大腸埃希菌組；B：金黃色葡萄球菌組；C：生理鹽水組；紅色箭頭所示為胰腺；藍色箭頭所示為心臟

ns：差異無統(tǒng)計學意義；*：P<0.01

Figure5Quantitative results of target and non-target PET/CT imaging of three groups of rats

2.5 生物學分布 大腸埃希菌感染組胰腺的示蹤劑攝取劑量為(1.33±0.11)%ID/g，金黃色葡萄球菌感染組的攝取劑量為(1.38±0.11)%ID/g，生理鹽水組的示蹤劑所測劑量為(0.71±0.08)%ID/g。見圖6。兩個感染組與生理鹽水組結果比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)。組織學分布情況：心臟攝取量最高，胰腺次之；兩個細菌感染組之間相比，胰腺組織放射性分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖7。

圖6 示蹤劑各組織攝取結果圖

ns：差異無統(tǒng)計學意義；*：P<0.001

Figure7Quantitative results of pancreas distribution of three groups of rats

3 討論

近年來，急性胰腺炎的發(fā)病率呈上升趨勢，這可能與人們經(jīng)濟水平的改善和飲食習慣及結構的改變有關[7]。急性胰腺炎并發(fā)感染后，診斷和治療的復雜性顯著增加，若患者未得到及時精準的治療干預，病死率明顯升高[3]。有報道[8]指出，急性胰腺炎并發(fā)感染后，病死率是無感染患者的兩倍。急性胰腺炎并發(fā)感染后病情復雜，病程遷延，花費巨大，可顯著增加住院總花費，是延長總住院時間的第二大因素，也是導致患者死亡的第5大原因[7]。

SAP繼發(fā)感染時主要通過以下幾個指標予以提示：(1)臨床癥狀改變：腹痛或者壓痛，肌緊張或者腸鳴音消失；(2)至少符合全身炎癥反應綜合征診斷標準中的2項；(3)影像學：CT發(fā)現(xiàn)胰腺周圍組織存在氣泡征象；(4)診斷性穿刺，細菌培養(yǎng)結果陽性。滿足4項中任意3項，可以診斷繼發(fā)感染[9]。同時，降鈣素原對繼發(fā)感染的診斷有一定的預測價值[10]。傳統(tǒng)的影像學檢查如增強CT，雖然是診斷重癥胰腺炎的金標準，并且可以發(fā)現(xiàn)胰腺壞死情況并評估壞死的程度，且根據(jù)Balthazar CT分級標準對病死率有一定的預測價值，但是繼發(fā)感染的診斷均需要依賴于氣泡征象的出現(xiàn)，且氣泡征象出現(xiàn)的概率非常低，患者一般在出現(xiàn)癥狀后48 ～72 h才能夠檢測到該征象[11-13]，所以，在感染發(fā)生早期很難判斷感染的類型及遷延范圍。引起繼發(fā)感染的病原菌為革蘭陰性菌，且感染類型較為單一，如得不到及時有效的治療，常繼發(fā)多重感染且細菌產(chǎn)生耐藥性[14]。因此，急需發(fā)現(xiàn)一種既可以降低穿刺風險，又可以提高診斷準確性和時效性的科學方法。

數(shù)十年以來，核醫(yī)學成像技術一直是感染性疾病和非感染性炎癥疾病成像的重要組成部分[15-16]。18F-FDG PET/CT與傳統(tǒng)放射性核素顯像方法和單獨形態(tài)成像相比有以下優(yōu)點：(1)檢測敏感性高；(2)圖像分辨率高；(3)靶區(qū)與背景比值高；(4)采集快速，一次完成。在無菌性炎癥和感染發(fā)生部位，局部免疫反應導致粒細胞和巨噬細胞聚集，其細胞內的葡萄糖代謝隨著炎癥反應而顯著增加，所以18F-FDG可以特異聚集于病灶部位，其早期診斷的敏感性和特異性均在90%以上，已經(jīng)被用于多種無菌性炎癥/感染疾病的研究中[15-17]。本研究結果顯示，繼發(fā)細菌感染時可以加速疾病的進展，增加感染部位示蹤劑的攝取量。PET/CT具有較高的組織分辨率，18F-FDG可以在無菌性炎癥和感染發(fā)生部位快速聚集，與傳統(tǒng)結構影像方法相比，利用功能顯像以及該方法反映和評估疾病早期的活動和進展具有明顯的優(yōu)勢。

18F-FDG PET/CT顯像在鑒別感染性疾病和無菌性炎癥中具有潛在的優(yōu)勢：在疾病發(fā)展早期，組織和器官結構上往往沒有明顯改變，故而相較于結構影像方法，功能顯像在診斷時效上具有無可比擬的優(yōu)勢，且一次PET顯像就可以進行全身評估[17]。盡早地診斷感染病灶，可以及時給予抗菌藥物治療，合理使用抗菌藥物，從而降低細菌耐藥性的產(chǎn)生。

本研究結果顯示，18F-FDG PET/CT并不能鑒別繼發(fā)感染是由哪種細菌感染引起，雖然兩種細菌在體外攝取實驗中存在吸收率的差異，但是在體內實驗差異并不顯著，因此，18F-FDG PET/CT不適宜用于檢測感染病原體。18F-FDG PET/CT掃描雖然可以提示臨床醫(yī)生存在感染，從而減少抗菌藥物的濫用，在一定程度上減少多重耐藥菌的擴散；但是，由于對預測病原體無明顯意義，對合理選用抗菌藥物無指導價值；因此，探索檢測感染病原體類型的特異顯像劑的研究意義重大。 目前，18F-FDG還原產(chǎn)物18F-FDS(2-脫氧-2-氟-山梨醇)是一種比較有前途的針對腸桿菌科細菌靶向標記示蹤劑[18-20]。盡管如此，18F-FDG PET/CT由于價格昂貴，采集過程時間較長等原因，目前18F-FDG PET/CT主要應用于腫瘤疾病的診斷和分期中，在包括SAP繼發(fā)感染在內的無菌性炎癥/感染疾病中的應用尚未廣泛開展。

本研究中SAP動物模型的構建至關重要。目前，應用最廣泛的方法是逆行胰腺膽管微泵注射法，選用的試劑通常為1.5% ～ 5%的牛黃膽酸鈉[21-22]。研究[23]顯示牛黃膽酸鈉注射濃度過高，動物死亡率增加，濃度過低時，胰腺組織病理學和生化指標與高濃度時存在差異。因此，本研究選擇中位濃度3.6%。本研究中“兩步走”建立繼發(fā)感染模型的優(yōu)點在于：(1)不需要將細菌和高濃度的?；悄懰徕c混合，從而造成細菌的死亡；(2)建立具有優(yōu)良效果的動物模型[24]。有報道[25]顯示應用頭皮針花費較低，操作簡便。但是，本研究發(fā)現(xiàn)使用頭皮針構建模型時，容易對十二指腸乳頭和胰腺管道造成損傷，誘導劑外溢引發(fā)造模失敗。本研究采用操作步驟較為繁瑣，但相對來說較為安全的24G靜脈留置針作為穿刺注射器。

本研究中選擇大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作為研究菌株，原因在于大腸埃希菌是人體腸道常見的機會致病菌，金黃色葡萄球菌是人體皮膚呼吸道黏膜機會致病菌[26]。引起SAP繼發(fā)感染的病原體以大腸埃希菌為主，可以達到15%以上[27]。近十年來，SAP患者中預防性使用抗菌藥物來降低病死率已經(jīng)達成共識；但是，長期使用抗菌藥物是繼發(fā)真菌感染和耐藥菌感染的一個危險因素；因此，及時發(fā)現(xiàn)感染并檢測病原體，從而合理給予抗菌藥物是減輕抗菌藥物選擇壓力、降低多重耐藥菌的產(chǎn)生和擴散[5，26，28-30]。為探索18F-FDG PET/CT早期顯像的時效性，本實驗將顯像時間大大提前，顯像時間定為細菌定植感染后3 h，是細菌穩(wěn)定后的快速增長期。目前，國內外研究顯像時間一般以天計數(shù)，感染后數(shù)小時內的早期顯像研究報道較少[18-19]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)18F-FDG PET/CT在SAP繼發(fā)感染的早期識別中有著重要價值，這不但有助于提高對疾病及繼發(fā)改變的認識，也為抗菌藥物早期應用提供依據(jù)，從而降低多重耐藥菌的產(chǎn)生和擴散。本研究尚存在一些局限，如實驗動物數(shù)量有限、類型單一；動物模型構建的繼發(fā)感染與人體內復雜的疾病可能不同；細菌定植和增長過程中缺少動態(tài)監(jiān)測的指標和可視化數(shù)據(jù)。目前，SAP的早期診斷仍需更多實驗進一步探索研究。

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