關 皎，王 強，孫宇慧，費 雪，王黎明，郝乘儀，馮 波，朱鶴云

(吉林醫(yī)藥學院藥學院,吉林 吉林 132013)

甘草在中藥傳統(tǒng)方劑中頻繁使用，有“十方九草”之說。甘草具有補脾益氣、淸熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[1]。甘草中主要含有三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類和多糖類成分，其中三萜皂苷類(代表藥物為甘草酸)和黃酮類(代表藥物為甘草苷)為甘草中的主要活性成分。研究表明，甘草酸具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、保肝、調(diào)節(jié)免疫、促進吸收等多種藥理活性[2-3]，甘草苷具有抗抑郁、保肝、神經(jīng)保護等藥理活性，同時對心肌缺血具有較好的治療作用[4-6]。目前關于甘草的質(zhì)量研究已有多篇文獻報道，采用的方法包括紫外法[7]、熒光法[8]、高效液相色譜法[9-10]等。然而，這些方法存在樣品前處理方法復雜、方法專屬性和靈敏度差、分析時間過長等缺點。超快速液相色譜(ultra-fast liquid chromatography,UFLC)技術由于存在分析效率高、平衡時間短、溶劑消耗少等優(yōu)點，近年來廣泛應用于中藥及中藥復方的化學分析研究[11-12]。本研究首次采用UFLC法同時測定甘草及其炮制品中甘草苷和甘草酸的含量，旨在為甘草的藥效物質(zhì)基礎和質(zhì)量控制研究提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20AD UFLC色譜儀系統(tǒng)，包括自動進樣裝置、二元高壓輸液泵、柱溫箱，紫外檢測器，LC solution色譜工作站；KQ-250DE型數(shù)控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)。

甘草藥材(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古)購自吉林大藥房，由吉林醫(yī)藥學院藥劑學教研室李景華副教授進行鑒定，確定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。炙甘草(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古)購自吉林大藥房。

色譜純乙腈和甲醇均購自美國Fisher公司，所用水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。對照品甘草苷(批號111610-201607)購自中國食品藥品檢定研究院，甘草酸(批號151014)購自成都普菲德生物技術有限公司，各對照品質(zhì)量分數(shù)均大于98%。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取甘草苷和甘草酸對照品適量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別配制含甘草苷1.0 g/mL和甘草酸1.0 g/mL的對照品溶液備用。

2.2 供試品溶液的制備

稱取預先通過40目篩的甘草藥材粉末約0.2 g，置25 mL具塞碘量瓶中，加入50%乙醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min后，放冷，再次稱定重量，并用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Shimadzu Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm,2.2 m)；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～4 min，5%～20%乙腈；4～8 min，20%～40%乙腈；8～12 min，40%～45%乙腈，平衡時間2 min；體積流量0.8 mL/min；檢測波長237 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。色譜圖見圖1。

圖 1 混合對照品(A)和甘草樣品(B)的色譜圖

2.4 線性關系考察

分別精密吸取“2.1”項下的制備甘草苷和甘草酸對照品溶液適量，置于相同5 mL容量瓶中，用甲醇-水(50∶50,v/v)配制成甘草苷和甘草酸濃度均為10、20、50、100、200、500 mg/L的混合對照品溶液，依次注入UFLC，以峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度X(mg/L)為橫坐標，獲得甘草苷和甘草酸的線性回歸方程分別為：

Y=13 566X+59 140，R=0.999 8

Y=3 615.7X+10 400，R=0.999 9

結果表明，甘草苷與甘草酸濃度在10～500 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5 精密度實驗

分別精密吸取混合對照品溶液(甘草苷與甘草酸濃度分別為100 mg/L)5 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果甘草苷和甘草酸峰面積的RSD(n=6)分別為0.4%和0.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一批次的甘草樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄峰面積。結果甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.7%和1.9%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性實驗

取同一批甘草藥材樣品共6份，精密稱定，分別制備樣品溶液，進樣分析，計算甘草苷和甘草酸的含量分別為1.85%和4.85%，RSD分別為1.6%和2.3%，表明方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量(甘草苷和甘草酸含量分別為1.85%和4.85%)的甘草樣品粉末9份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入相當于樣品中甘草苷和甘草酸含量的80%、100%、120%的對照品溶液適量，各3份。制備樣品溶液，進樣分析，計算甘草苷和甘草酸的加樣回收率和RSD，結果甘草苷的加樣回收率為98.9%、99.5%、98.4%，RSD為1.5%、2.1%、0.9%；甘草酸的加樣回收率99.2%、99.4%、99.4%，RSD為2.2%、1.3%、1.2%。

2.9 樣品含量測定

精密稱取6批甘草樣品粉末(其中1～3批為生甘草，4～6批為炙甘草)，制備樣品溶液，進樣分析，每個溶液進樣3次，計算甘草苷和甘草酸的含量。樣品測定結果見表1。

表 1 樣品中甘草苷、甘草酸的含量測定結果(n=6，%)

3 討 論

3.1 流動相的優(yōu)化

實驗比較考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1.0%甲酸水、乙腈-1.0%乙酸水、乙腈-0.05%磷酸水共5種流動相體系，結果表明，在確定的波長下，乙腈-0.05%磷酸水所得基線更平穩(wěn)，各色譜峰的分離度更好，且色譜分析時間僅為15 min。

3.2 檢測波長的選擇

采用PDA檢測器對樣品在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，甘草苷和甘草酸分別在276 nm和248 nm處有最大吸收。綜合比較發(fā)現(xiàn)237 nm波長下檢測的色譜圖基線平穩(wěn)，各主要特征峰吸收強度較大，故選定該波長作為檢測波長。

3.3 提取方法及提取溶劑的選擇

實驗中考察了回流法和超聲法提取甘草中甘草苷和甘草酸的提取效果，采用超聲提取法時兩種活性成分的含量明顯高于回流提取法。本實驗對比不同比例乙醇溶液和不同比例甲醇溶液對甘草中2種活性成分的提取效率，結果表明50%乙醇的綜合提取效率最高，故本實驗采用50%乙醇作為提取溶劑。

本研究采用UFLC法同時測定了3批生甘草和3批炙甘草中上述2種活性成分的含量。購自吉林大藥房的3批生甘草和3批炙甘草的含量均符合藥典要求(藥典規(guī)定甘草中甘草苷含量不低于0.50%，甘草酸含量不低于2.0%；炙甘草中甘草苷含量不低于0.50%，甘草酸含量不低于1.0%)。但炮制后甘草中2種活性成分含量下降，與文獻報道結果一致[11]，甘草炮制后含蜂蜜固形物量增加有關約為11.8%，若扣除含蜂蜜固形物的量，炮制后甘草苷和甘草酸的平均含量均高于生品，由此可見甘草經(jīng)蜜炙后入藥具有一定的科學性。

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