伍慧雄，方萍，張偉豪，王偉，歐陽錦逵，單體江

(廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

南美蟛蜞菊Wedeliatrilobata(L.) Hitchc，又名三裂葉蟛蜞菊、地錦花、穿地龍等，為菊科Aste-raceae蟛蜞菊屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲及中美洲地區(qū)，20世紀(jì)70年代作為綠化地被植物引進(jìn)我國(guó)，因其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖速度快，定居后很快逃逸為野生[1-5]。南美蟛蜞菊被列為世界最有害的100種外來入侵物種之一[1,6]，同時(shí)也是廣東省主要的外來入侵植物之一，目前已成為華南地區(qū)危害性嚴(yán)重的雜草，對(duì)花生、水稻等農(nóng)作物危害較大，嚴(yán)重破壞森林生態(tài)環(huán)境，威脅生態(tài)物種的多樣性，并造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。

入侵植物生態(tài)適應(yīng)能力強(qiáng)，不僅是受其本身的生物學(xué)特性影響，其產(chǎn)生的豐富的生態(tài)化學(xué)物質(zhì)也起到了重要作用[9]。外來入侵植物可通過根部分泌化感物質(zhì)進(jìn)入土壤，通過直接或間接的方式改變土壤微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而改變土壤微生物群落組成和功能，提高競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[10]。因此對(duì)于南美蟛蜞菊的研究也主要集中于化感作用和生物學(xué)特性等方面，包括對(duì)各種雜草、水稻和花生等農(nóng)作物以及各種蔬菜的化感作用[7-8,10-14]。南美蟛蜞菊揮發(fā)油具有一定的抗菌活性[15]和對(duì)害蟲的拒食、毒殺等活性[16-17]，對(duì)畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見致病細(xì)菌以及人體病原細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，且隨著揮發(fā)油濃度的增大，其抑菌活性增強(qiáng)[18-19]。然而目前尚未見南美蟛蜞菊對(duì)農(nóng)業(yè)和林業(yè)病原細(xì)菌抗菌活性的報(bào)道。

本研究通過水蒸汽蒸餾法提取南美蟛蜞菊花中的揮發(fā)油，分析和鑒定其化學(xué)組成，并通過抑菌圈法測(cè)定了南美蟛蜞菊花揮發(fā)油對(duì)6種供試細(xì)菌的抑菌活性，以期為外來入侵植物的防控以及南美蟛蜞菊綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 南美蟛蜞菊花于2014年7月21采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，標(biāo)本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院鄭明軒老師鑒定。

供試細(xì)菌：枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，G+，桉樹青枯菌Ralstoniasolanacearum，G-，番茄瘡痂病菌Xanthomonasvesicatoria，G-，黃瓜角斑病菌Pseudomonaslachrymans，G-，大腸桿菌Escherichiacoli，G-以及根癌土壤桿菌Agrobacteriumtumefaciens，G-，以上菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院森保教研室提供。

1.2 儀器與試劑 水蒸汽蒸餾裝置(北京永光明醫(yī)療儀器廠)；6890N-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)(Agilent Technologies，USA)；正構(gòu)烷烴C8-C40,硫酸鏈霉素(美國(guó)Sigma公司)；氯化鈉、無水乙醚、無水硫酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純(北京化學(xué)試劑公司)。

1.3 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油的提取及其GC-MS分析 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油的提取參照Lou等[20]的方法，花揮發(fā)油化學(xué)組分的鑒定在6890N-5975C GC-MS(Agilent Technologies，USA)上進(jìn)行，色譜柱為DB-5(30 m × 250 μm × 0.25 μm)，無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。升溫程序：進(jìn)樣口溫度230 ℃，起始溫度70 ℃，保持1 min，以8 ℃/min上升到120 ℃，保持1 min，以30 ℃/min上升到150 ℃，保持1 min，以5 ℃/min上升到175 ℃，保持0 min，再以1 ℃/min上升到180 ℃，保持0 min，最后以5 ℃/min上升到240 ℃，保持0 min。離子源溫度230 ℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，載氣為He，流速1 mL/min，全掃描采集，質(zhì)譜檢測(cè)器(MSD)檢測(cè)。通過NIST(2011)譜庫檢索，與標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖作對(duì)比，確定待測(cè)成分。保留系數(shù)(retention index，RI)的測(cè)定參照Wang[21]和Van den Dool[22]等的方法。

1.4 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油抗菌活性的測(cè)定 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油抗細(xì)菌活性的測(cè)定參照趙文越[23]等的方法，在活性測(cè)定前，先用LB 平板進(jìn)行活化培養(yǎng)(28℃，暗)48 h，然后挑取單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中搖培( 28 ℃，暗，150 rpm ) 24 h，將菌液濃度稀釋到108cfu /mL，備用。倒好平板后，用移液槍分別吸取50 μL菌液，用玻璃棒涂板。用鑷子夾取直徑6 mm的無菌濾紙片放在帶菌平板上，每皿放置3片，濾紙片保持一定的距離，每片濾紙片滴加5 μL的供試揮發(fā)油，陽性對(duì)照為5 μL 0.2%硫酸鏈霉素，空白對(duì)照為5 μL無菌水。而后在28 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)24 h，用尺子量取抑菌圈直徑的大小，每個(gè)處理重復(fù)3次。采用SAS 8.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，顯著性差異水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油化學(xué)成分分析 采用水蒸汽蒸餾法提取南美蟛蜞菊花中的揮發(fā)油，得率為0.067% (以鮮重為基礎(chǔ))。南美蟛蜞菊花揮發(fā)油總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油總離子流色譜圖

通過GC-MS分析，各組分峰用NIST Library(2011版) 質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索，從南美蟛蜞菊花中共鑒定出46個(gè)組分，占總相對(duì)含量的91.90%，采用GC峰面積歸一化法定量分析，計(jì)算出各成分的相對(duì)含量，南美蟛蜞菊花揮發(fā)油組分及其相對(duì)含量見表1。其中主要成分為(1R)-α-蒎烯(28.22%)、D-檸檬烯(14.82%)、間異丙基甲苯(7.51%)、α-水芹烯(4.11%)、(-)-Alloisolongifolene(3.52%)和Eudesma-3,7(11)-diene(2.52%)，其余成分的相對(duì)含量均在2.50%以下。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與海南海口的南美蟛蜞菊花揮發(fā)油[4]，廣東潮州的南美蟛蜞菊葉揮發(fā)油[24]以及廣西桂林[9]、廣東揭陽[15]、海南?？赱25]和福建福州[19]的南美蟛蜞菊地上部分揮發(fā)油比較發(fā)現(xiàn)，無論是化合物的組成還是化合物的相對(duì)含量，均存在較大差異，但其主要成分相差不大，均為α-蒎烯、D-檸檬烯和α-水芹烯等。說明南美蟛蜞菊揮發(fā)油的化學(xué)成分與樣品產(chǎn)地、植株部位、分析方法以及采集時(shí)間等因素有關(guān)。以上結(jié)果表明，南美蟛蜞菊花中含有種類豐富的揮發(fā)性成分。這些化學(xué)成分是否與南美蟛蜞菊極強(qiáng)的生物入侵性以及化感作用有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

2.2 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油對(duì)6種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用，但對(duì)不同細(xì)菌的抑制活性差異顯著(圖2)。南美蟛蜞菊花揮發(fā)油對(duì)黃瓜角斑病菌的抑制活性最強(qiáng)(圖3e)，其次為番茄瘡痂病菌(圖3c)，抑菌圈直徑分別為(21.0±1.0) mm和(15.7±1.5) mm，其中對(duì)黃瓜角斑病菌的抑制活性要明顯強(qiáng)于陽性對(duì)照硫酸鏈霉素(抑菌圈直徑為(18.0±1.0) mm；而對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性較弱，抑菌圈直徑分別為(8.2±0.3) mm和(10.3±0.6) mm。南美蟛蜞菊花揮發(fā)油對(duì)桉樹青枯病菌(圖3b)及根癌土壤桿菌(圖3a)的抑菌圈直徑分別為(12.0±0.5) mm和(14.0±0.5) mm，其對(duì)桉樹青枯病菌的抑菌活性與陽性對(duì)照硫酸鏈霉素(抑菌圈直徑為(13.0±1.0) mm)相比相差不大。

表1 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油成分及其含量測(cè)定結(jié)果

續(xù)表

圖2 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性

注：根癌土壤桿菌(a)，桉樹青枯病菌(b)，番茄瘡痂病菌(c)，枯草芽孢桿菌(d)，黃瓜角斑病菌(e)，大腸桿菌(f)圖3 南美蟛蜞菊花揮發(fā)油對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性

3 討論

外來植物入侵已成為全球性問題，我國(guó)是外來植物入侵嚴(yán)重的國(guó)家之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)已知外來入侵植物達(dá)352種[1,9,26]；至2010年，廣東省外來入侵植物有99種[7]。外來入侵植物不僅破壞生態(tài)系統(tǒng)，威脅本地物種的生存，導(dǎo)致生物多樣性喪失，還嚴(yán)重威脅著農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，甚至直接影響人類健康[9,11,26]。本研究從廣州的南美蟛蜞菊花揮發(fā)油中共鑒定出46個(gè)組分，占總相對(duì)含量的91.90%，其中主要成分為(1R)-α-蒎烯、D-檸檬烯、間異丙基甲苯和α-水芹烯。南美蟛蜞菊雖為入侵植物，但具有清熱解毒、涼血止血、消炎退腫、利咽止咳等功效[2,4,24,27-29]。外來入侵植物產(chǎn)生的生態(tài)化學(xué)物質(zhì)也是優(yōu)良的植物保護(hù)劑，具有較好的開發(fā)利用價(jià)值[9]。南美蟛蜞菊揮發(fā)油含有大量芳香族類化合物，尤其是萜類化合物，其主要成分α-蒎烯有明顯鎮(zhèn)咳和祛痰功能，并有抗真菌(如白念珠菌)、驅(qū)蟲、殺蟲、除螨的作用[30]；水芹烯廣泛存在于各種精油和香精香料中[31]；D-檸檬烯可鎮(zhèn)咳、祛痰、抗菌，對(duì)肺炎雙球菌、甲型鏈球菌、卡他雙球菌、金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制作用[32]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也表明南美蟛蜞菊花揮發(fā)油對(duì)黃瓜角斑病菌和番茄瘡痂病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，對(duì)桉樹青枯病菌抑制活性與陽性對(duì)照硫酸鏈霉素相差不大，可能與揮發(fā)油中的主要成分有關(guān)。如果將南美蟛蜞菊開發(fā)成植物源農(nóng)藥進(jìn)行利用，就能變害為利，既可控制入侵植物的危害，又能生產(chǎn)出低毒、低殘留、低耐藥性等對(duì)環(huán)境安全的無公害植物源農(nóng)藥產(chǎn)品[9]，本研究結(jié)果將為南美蟛蜞菊的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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