程方，葉建仁

(1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037； 2 廣東省惠州市惠城區(qū)生態(tài)公益林管理站，廣東 惠州 516001)

松針褐斑病(Lecanostictaacicola)是一種重要的國(guó)內(nèi)森林植物檢疫對(duì)象，在我國(guó)濕地松Pinuselliottii林中普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響了濕地松的推廣應(yīng)用。葉建仁 等[1]在福建官莊林場(chǎng)建立了抗病種子園，但是抗性種子產(chǎn)量有限，為加速濕地松優(yōu)良材料的推廣進(jìn)程，該研究小組通過器官發(fā)生獲得移栽成活的再生植株[2-3]。植物的性狀表現(xiàn)是基因型和環(huán)境綜合作用的結(jié)果，經(jīng)過人工培養(yǎng)的再生植株可能會(huì)出現(xiàn)變異，子代組培苗是否具有母株的優(yōu)良抗病性，需要在組培苗生長(zhǎng)后期進(jìn)行抗病性測(cè)定。人工接種孢子懸浮液測(cè)定濕地松抗病性，需要組培再生植株移至溫室盆里或田間苗圃，而毒素檢測(cè)，快捷方便；若用松針褐斑病菌毒素處理瓶?jī)?nèi)組培苗測(cè)定抗病性的結(jié)果與室外人工接種孢子懸浮液測(cè)定的結(jié)果具有相關(guān)性，則可以在瓶?jī)?nèi)測(cè)定組培苗抗病性，及時(shí)淘汰不良無性系，將會(huì)大大縮短抗病選育的時(shí)間。作者通過測(cè)定濕地松組培苗3個(gè)培育階段抗病性，確定濕地松組培苗間的抗病性差異以及3個(gè)階段的測(cè)定結(jié)果是否具有相關(guān)性，以期為更早期篩選出濕地松組培苗優(yōu)良抗病無性系提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試濕地松和松針褐斑病菌 南京林業(yè)大學(xué)抗病育種實(shí)驗(yàn)室的瓶?jī)?nèi)抗病組培苗32#3、8#11、8#2、8#40，普通組培苗；溫室濕地松抗病組培苗32#3、32#7，普通組培苗針葉；2008年3月移栽到南京林業(yè)大學(xué)南大山苗圃的濕地松組培苗和實(shí)生苗。濕地松組培苗均來自濕地松器官發(fā)生植株再生體系。南京林業(yè)大學(xué)森林病理研究組提供松針褐斑病菌。

1.1.2 松針褐斑病菌毒素 采用程方 等[4]的制備方法制備松針褐斑病菌毒素。

1.1.3 松針褐斑病菌孢子懸浮液 將松針褐斑病菌恒溫25 ℃下培養(yǎng)16～20 d，用2%蔗糖-滅菌水洗下分生孢子，經(jīng)兩層粗紗布濾去雜物，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至3×107個(gè)/mL 備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 松針褐斑病菌毒素生測(cè)瓶?jī)?nèi)組培苗 采用程方 等[4]的毒素生測(cè)方法處理濕地松瓶?jī)?nèi)32#3、8#11、8#2、8#40和普通組培苗，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株苗。以培養(yǎng)基表面含不接菌的小麥浸提液轉(zhuǎn)接普通組培苗為對(duì)照。

1.2.2 松針褐斑病菌毒素生測(cè)溫室組培苗針葉 采用程方 等[4]的毒素生測(cè)方法處理濕地松溫室32#3、32#7和一年生普通組培苗針葉，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15根針葉。以不接菌的小麥浸提液接種普通組培苗針葉為對(duì)照。

1.2.3 苗圃組培苗人工接種松針褐斑病菌孢子懸浮液 用噴霧器將制備好的濃度為3×107個(gè)/mL的松針褐斑病菌孢子懸浮液均勻噴在所選植株上，至針葉開始有水流動(dòng)為止；然后蓋上塑料薄膜，間歇向袋中噴清水保濕降溫5 d，防止中午溫度過高，在接種植株上方搭建蔭棚。以2%蔗糖無菌水為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3～4株苗。接種45 d統(tǒng)計(jì)感病率和感病指數(shù)。孢子懸浮液滴于凹面載玻片上分別置于苗圃薄膜棚內(nèi)和室溫下，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率分別約為32%和27%。

1.3 感病率和感病指數(shù)統(tǒng)計(jì) 每天觀察組培苗及針葉的發(fā)病情況；當(dāng)針葉開始發(fā)病、普遍發(fā)病時(shí)，統(tǒng)計(jì)各無性系的感病指數(shù)和感病率。濕地松組培苗感病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]見表1，針葉感病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]見表2。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用Excel整理、SPSS軟件分析。

感病指數(shù)=∑(各級(jí)別代表值×該級(jí)別株數(shù))×100/總株數(shù)×發(fā)病最重級(jí)代表數(shù)值

感病率(%)=(感病株數(shù)/接種株數(shù))×100

表1 濕地松組培苗感病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表2 針葉感病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 濕地松瓶?jī)?nèi)組培苗的抗病性比較

2.1.1 不同家系間的抗病性比較 供試濕地松組培苗不同家系間抗病性差異顯著，抗病性強(qiáng)弱依次為8#，32#，普通組培苗。普通組培苗的感病率和感病指數(shù)均明顯高于兩個(gè)抗病家系，其中8#家系抗病性又明顯高于32#。感病率在4，7 d時(shí)，不同家系間差異分別都顯著(圖1)。

圖1 松針褐斑病菌毒素處理濕地松瓶?jī)?nèi)組培苗后的感病指數(shù)和感病率比較

2.1.2 同一家系不同無性系間的抗病性比較 濕地松瓶?jī)?nèi)組培苗同一家系不同無性系對(duì)毒素的反應(yīng)差異明顯，不同無性系的抗病性差異顯著。8#的3個(gè)無性系中，8#40抗性最強(qiáng)，感病指數(shù)僅為15，明顯低于8#11的感病指數(shù)30，比8#2的感病指數(shù)低12.5。8#40在7 d時(shí)感病率為50%，比最高值8#11的感病率低了12.5%，盡管8#2和8#11在初期的感病率差異不顯著，但是在7 d時(shí)8#40、8#2、8#11的感病指數(shù)和感病率之間差異均分別顯著(P<0.05)(圖2)。

圖2 松針褐斑病原菌毒素處理濕地松瓶?jī)?nèi)組培苗后同一家系的感病指數(shù)和感病率比較

2.1.3 所測(cè)無性系的抗病性比較 濕地松瓶?jī)?nèi)組培苗經(jīng)松針褐斑病菌毒素處理后，4個(gè)抗病無性系均比普通組培苗抗病性強(qiáng)，其中8#40抗性最強(qiáng)，第7天統(tǒng)計(jì)的感病指數(shù)僅為15，感病率也低于普通組培苗33.33%，各無性系抗病性強(qiáng)弱依次為8#40，8#2，8#11，32#3，普通濕地松組培苗(圖3，4，5)。

圖3 松針褐斑病菌毒素處理濕地松瓶?jī)?nèi)組培苗后的感病指數(shù)和感病率比較

圖4 松針褐斑病菌毒素處理濕地松瓶?jī)?nèi)組培苗前

圖5 松針褐斑病菌毒素處理濕地松瓶?jī)?nèi)組培苗第7天

2.2 濕地松溫室組培苗不同無性系的抗病性比較 松針褐斑病菌毒素處理濕地松溫室組培苗針葉4 d時(shí)，32#7和32#3的感病率差異不顯著，但在7 d時(shí)，32#7感病率比32#3低30%，且都明顯高于普通組培苗，可見抗病性都顯著高于普通組培苗(圖6)?？共⌒杂蓮?qiáng)到弱為32#7，32#3，普通組培苗。

圖6 松針褐斑病菌毒素處理溫室濕地松組培苗針葉后不同無性系的感病率和感病指數(shù)

2.3 苗圃濕地松組培苗的抗病性比較

2.3.1 普通組培苗不同代數(shù)間的抗病性比較 人工接種松針褐斑病菌孢子懸浮液20 d時(shí)，普通組培苗1～3代有2株發(fā)現(xiàn)病斑，4～6代有2株發(fā)病，有1株發(fā)病較重，7～9代有2株發(fā)病。接種45 d時(shí)，普通組培苗4～6代、1～3代均有1株基部發(fā)病嚴(yán)重，但是新葉未發(fā)病。普通組培苗1～3代、4～6代都對(duì)松針褐斑病孢子入侵反應(yīng)迅速，但是4～6代在后期抗病性比1～3代強(qiáng)，感病指數(shù)及感病率都明顯低于1～3代和7～9代；7～9代盡管前期反應(yīng)慢，但后期感病迅速，感病率達(dá)到了100%，感病指數(shù)也高達(dá)55.6，明顯高于1～3代和4～6代。由此可知，普通組培苗4～6代的抗病性大于1～3代，大于7～9代(圖7，8)。

圖7 苗圃普通濕地松組培苗不同代數(shù)間的感病指數(shù)和感病率比較

圖8 苗圃濕地松普通組培苗人工接種孢子懸浮液45 d不同代數(shù)的感病情況

2.3.2 組培苗與實(shí)生苗間的抗病性比較 人工接種松針褐斑病菌孢子懸浮液20 d時(shí)，8#、32#家系實(shí)生苗沒有表現(xiàn)出癥狀，普通實(shí)生苗個(gè)別有病斑，有2株苗各有1個(gè)病斑；45 d時(shí)，實(shí)生苗無論是抗病的還是普通的，感病率均較高，32#家系實(shí)生苗有6株嚴(yán)重感病，8#家系實(shí)生苗和普通實(shí)生苗分別有3株感病嚴(yán)重；說明實(shí)生苗在接種前期比較耐病，發(fā)病比組培苗慢，但是在后期抗病性卻不及組培苗。同期組培苗的抗病性大于實(shí)生苗，8#、32#、普通實(shí)生苗的感病率均達(dá)到了100%，而普通組培苗只有70%?？共〖蚁档慕M培苗與其他家系差異顯著，感病率明顯低于其他家系，僅為25%。就感病指數(shù)分析，實(shí)生苗抗病性顯著低于8#抗病家系組培苗和普通組培苗(圖9，10)。各家系的抗病性強(qiáng)弱依次為8#組培苗，普通組培苗，8#實(shí)生苗，普通實(shí)生苗，32#實(shí)生苗。

2.3.3 組培苗同一家系不同無性系的抗病性比較 人工接種松針褐斑病菌孢子懸浮液20 d時(shí)，8#8有1株有少許病斑，8#4有2株有少許病斑。同一家系不同無性系間抗病性差異顯著，接種45 d時(shí)，8#4只有3株感病，8#4的其它植株均未感病或感病很輕，感病率僅為12.5%，感病指數(shù)也僅為3.1，屬于高抗無性系。8#8感病指數(shù)和感病率顯著高于8#4，但也分別僅為9.38、37.5%，兩者的抗病性都強(qiáng)于普通組培苗(圖11，12)。

圖9 苗圃濕地松組培苗與實(shí)生苗的感病指數(shù)和感病率比較

圖10人工接種松針褐斑病菌孢子懸浮液45d時(shí)苗圃濕地松組培苗與實(shí)生苗的感病情況

圖11 苗圃濕地松組培苗不同無性系的感病指數(shù)和感病率比較

圖12 人工接種松針褐斑病菌孢子懸浮液45 d濕地松不同無性系的感病情況

2.4 瓶?jī)?nèi)組培苗與溫室苗圃組培苗抗病性測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性 以瓶?jī)?nèi)濕地松組培苗毒素處理的感病指數(shù)為X，以溫室濕地松組培苗針葉感病指數(shù)為Y1，通過對(duì)CK、普通組培苗、32#3的感病指數(shù)進(jìn)行單元回歸分析，得回歸方程：Y1=1.049X+0.105 5，r2=0.999 7。以瓶?jī)?nèi)毒素處理的感病指數(shù)為X，以苗圃感病指數(shù)為Y2，通過對(duì)CK、普通組培苗、8#的感病指數(shù)進(jìn)行單元回歸分析，得回歸方程：Y2=0.593 2X+2.124 8，r2=0.958 8。說明瓶?jī)?nèi)組培苗的抗病性測(cè)定結(jié)果在一定程度上與室外的測(cè)定結(jié)果相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

強(qiáng)化抗病育種是發(fā)展集約人工林的迫切需要，把育種目標(biāo)轉(zhuǎn)移到降低營(yíng)林成本的抗性育種和材質(zhì)改良方面，保證人工林的生物學(xué)穩(wěn)定性，真正實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效[7]。抗病家系子代能否像親本那樣表現(xiàn)出高度的抗病性還得經(jīng)子代抗病性測(cè)定才能確定。為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)某一材料的抗性，不僅要用將來大批量造林地區(qū)的菌系接種該材料，而且接種用菌系的取樣也要充分[7]。本研究的結(jié)果與安會(huì)翠 等[5]的研究結(jié)果一致，不同家系的抗病性差異顯著，同一家系不同無性系的抗病性差異也顯著，組培苗代數(shù)不同抗病性也存在差異。蔣繼宏 等[8]用松針褐斑病菌致病毒素處理不同抗性濕地松無性系針葉的結(jié)果與人工接種病原菌的結(jié)果存在高度相關(guān)，14種松樹的抗病性測(cè)定也基本上能表達(dá)它們?cè)瓉淼目共⌒浴Ｔx[9]用病原菌孢子人工接種和毒素粗提液生測(cè)的方法測(cè)定濕地松不同無性系的抗病性，兩種測(cè)定結(jié)果高度相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0.8)，說明用毒素進(jìn)

行抗病性篩選有一定可靠性。在瓶?jī)?nèi)測(cè)定抗病性低的32#3，溫室針葉測(cè)定結(jié)果抗性也低，在瓶?jī)?nèi)測(cè)定抗病性強(qiáng)的8#2與戴培培[10]在溫室測(cè)定的結(jié)果，及本研究苗圃測(cè)定的結(jié)果一致，抗病性較強(qiáng)。通過單元回歸分析表明濕地松組培苗在瓶?jī)?nèi)與溫室、苗圃進(jìn)行抗病性測(cè)定具有一定的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r2分別為0.999 7和0.958 8，但是由于試驗(yàn)材料有限，數(shù)據(jù)有限，因而只能說在一定程度上可以用瓶?jī)?nèi)抗病性測(cè)定替代室外抗病性測(cè)定，要得到更為精確地相關(guān)性分析，還需要進(jìn)行更多無性系的回歸分析試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 葉建仁,韓正敏,李傳道,等.濕地松抗褐斑病無性系種子園營(yíng)建技術(shù)研究[J ].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版,1991,15(2):23-29.

[2] 何月秋.濕地松抗病家系組培繁殖技術(shù)研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2003.

[3] 朱麗華,張藝,吳小芹.濕地松的組織培養(yǎng)及植株再生[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,28(6)：47-51.

[4] 程方,葉建仁,劉戈,等.松針褐斑病菌毒素處理后濕地松組培苗PAL、PPO、SOD活性變化研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,2012,25(4):521-525.

[5] 安會(huì)翠,葉建仁,吳小芹,等.濕地松子代組培苗對(duì)松針褐斑病的抗性測(cè)定[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,36(3):9-12.

[6] 黃向東,易正凡.松針褐斑病接種試驗(yàn)研究[J].湖南林業(yè)科技,1998,25(3):17-19.

[7] 馬常耕.國(guó)際林木抗病育種的基本經(jīng)驗(yàn)[J].世界林業(yè)研究,1995(4):14-21.

[8] 蔣繼宏,李傳道.濕地松對(duì)松針褐斑病的抗性測(cè)定[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1995,19(3):37-41.

[9] 曾義.濕地松抗松針褐斑病子代抗病性的研究[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2000.

[10]戴培培.濕地松組培快繁體系優(yōu)化及再生植株性狀表現(xiàn)[D].南京:南京林業(yè)大學(xué),2008.