唐正和，康懷蘭，劉翠明

(山東萊蕪鋼鐵集團(tuán)有限公司醫(yī)院內(nèi)分泌科，萊蕪 271126)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組因遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的臨床綜合征，而2型DM合并存在胰島素抵抗和脂代謝障礙。DM狀態(tài)下，炎癥反應(yīng)、自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化均可破壞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能，在肝病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用[1]。脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是脂肪組織中最豐富的基因產(chǎn)物之一，可加強(qiáng)胰島素抑制糖異生作用并抑制肝糖原的生成，具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，在機(jī)體脂質(zhì)代謝、血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控和血管生理作用中具有重要地位[2]。脂聯(lián)素受體(adiponectin receptor，AdipoR)是介導(dǎo)APN生物學(xué)作用的關(guān)鍵蛋白，而肝臟是AdipoR2高表達(dá)器官。大量的研究證實(shí)[3]，肥胖、胰島素抵抗、2型DM患者血清APN水平顯著變化，且與AdipoR2在靶器官的表達(dá)水平具有相關(guān)性。Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白-1(Wnt-induced secreted protein-1，WISP-1)是Wnt信號(hào)通路活化后的下游靶基因之一[4]，參與器官損傷修復(fù)，以及心、肺、肝等臟器纖維化的發(fā)生[5]，而DM肝損傷是否與WISP-1有關(guān)，報(bào)道較少。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)可通過參與APN蛋白相關(guān)的多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路的表達(dá)調(diào)控而參與糖脂代謝[6]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察DM大鼠APN分泌與Wnt信號(hào)通路下游靶基因WISP-1在肝損傷組織中的表達(dá)，分析DM肝損傷發(fā)生的病理生理機(jī)制，并探討SIRT1對(duì)APN分泌的調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

鏈脲菌素、SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇(resveratrol，RES)、SIRT1抑制劑尼克酰胺(niacin amide，NIA)(上海國(guó)藥試劑集團(tuán))；血糖試紙(強(qiáng)生中國(guó)醫(yī)療器材有限公司)；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG/小鼠IgG二抗試劑盒(北京中杉金橋生物)；TRIzol試劑盒(Roche，德國(guó))。單克隆抗體：AdipoR(Cell Signaling Technology公司，美國(guó))，WISP-1(Sigma公司，美國(guó))，SIRT1(LifeSpan，美國(guó))，β-actin(Ambobio，美國(guó))。7300型實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(Applied Biosystems，德國(guó))。

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量150～180 g，50只[由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(魯)2016-0121]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組10只和DM造模組40只。DM造模組采用高脂飲食(豬油30.0%，膽固醇2.5%，脫氧膽酸鈉1.0%，常規(guī)飼料66.5%)灌胃，并于5周末禁食12 h后，一次性腹腔注射1%鏈脲菌素(30 mg/kg，pH=4.5的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液)；正常對(duì)照組飼以普通飲食，注射同體積檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。造模后72 h尾靜脈采血，血糖試紙檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。以FBG≥11.1 mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和體質(zhì)量下降者為DM大鼠模型成功。DM造模成功大鼠隨機(jī)分為3組：DM組、DM+RES組和DM+NIA組，各組繼續(xù)以高脂飲食灌胃4周，4周后DM+RES組和DM+NIA組分別每日再給予RES和NIA，持續(xù)4周。對(duì)照組繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)8周。

1.2　方法

1.2.1胰島素敏感指數(shù)及肝損傷指標(biāo)檢測(cè)DM造模組大鼠分別于8周末禁食12 h，頸靜脈竇取血，離心分離血清，檢測(cè)FBG及空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)，公式為：ISI=ln[1/(FINS×FBG)]；同時(shí)檢測(cè)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino transferase，ALT)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等肝血清酶學(xué)指標(biāo)。

1.2.2標(biāo)本收集造模結(jié)束后，麻醉大鼠，仰位固定，開胸，腹主動(dòng)脈取血，5 ml/只，3000轉(zhuǎn)/ min離心10 min，取上清，分裝，-20℃保存待測(cè)。生化儀檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測(cè)APN水平。迅速取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水洗凈，取肝右葉分為兩部分：一部分用4%多聚甲醛固定，制成肝臟組織石蠟塊；另一部分置于液氮中保存待用。

1.2.3HE染色取石蠟切片常規(guī)脫蠟，蘇木素染色10 min，流水稍洗，1%的鹽酸乙醇分化，流水沖洗數(shù)分鐘，伊紅染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常規(guī)脫水，中性樹膠封片。Eclipse TE 2000-S免疫熒光顯微鏡拍照(Nikon，日本)，觀察肝臟組織病理結(jié)構(gòu)的改變。

在聽覺上，民族唱法的音色亮多暗少，而美聲的音色則相對(duì)較暗。在聲音位置上，兩種唱法也有不同之處，民族唱法高音轉(zhuǎn)為腦后音，不豎上頭頂，而美聲唱法要求高音必須豎在頭頂。

1.2.4Western bloting實(shí)驗(yàn)每20 mg組織加入100～200 μl含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fuoride，PMSF)的裂解液，研磨充分后，4℃下 14 000g離心10 min，取勻漿上清，并測(cè)定總蛋白濃度?？偟鞍?40～70 μg上樣量)于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進(jìn)行分離。濕法轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后，與相應(yīng)一抗4℃共孵育過夜。次日與辣根過氧化物標(biāo)記的二抗共孵育，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將肝組織均勻粉碎后按TRIzol提取程序(說明書)提取組織總RNA；按鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒(avian myeloblastic leukemia virus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，4℃保存。各目的基因的擴(kuò)增引物序列，如表1所示。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共 35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，快速冷卻至4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察，用Band Scan 5.0軟件測(cè)定條帶灰度值。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1　大鼠DM模型建立情況

DM造模組有5只大鼠造模后血糖檢測(cè)值未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，3只大鼠死亡，均剔除。DM組造模成功大鼠共32只，成功率為80%。隨機(jī)分到DM組、DM+RES組及DM+NIA組分別10、11和11只。

實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好、健壯、自主活動(dòng)正常。而DM造模組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、腥臊臭味加重，以及多飲、多食、多尿、體質(zhì)量降低等DM癥狀。與正常對(duì)照組相比，DM造模組大鼠進(jìn)食量[(33.41±4.29)vs(42.71±6.16)g/d]、飲水量[(54.01±8.77)vs(89.30±11.11)ml/d]和尿量[(7.88±3.17)vs(75.81±8.79)ml/d]均顯著增高(P<0.05)。檢測(cè)血糖相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，DM造模組大鼠血清FBG[(5.00±0.17)vs(32.30±3.11)mmol/L]和FINS[(21.27±0.62)vs(28.76±0.95)mU/L]顯著升高(P<0.05)，而ISI[(-4.67±0.45)vs(-6.83±0.70)]顯著下降(P<0.01)，表明2型DM大鼠造模成功。

2.2　4組大鼠血生化指標(biāo)檢測(cè)

與正常對(duì)照組比較，DM組大鼠血清FBG、TG、TC和LDL-C水平顯著增高，而HDL-C水平顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DM組相比較，F(xiàn)BG在DM+RES組顯著降低(P<0.05)，在DM+NIA組略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TC和LDL-C在DM+RES組顯著降低(P<0.01)，在DM+NIA組顯著升高(P<0.05)；TG在DM+RES組顯著降低(P<0.05)；HDL-C在DM+RES組顯著升高(P<0.01；表2)。

2.3　4組大鼠肝損傷指標(biāo)及血清APN水平檢測(cè)

血清肝功能指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠在造模8周后并發(fā)肝臟損傷，血清肝功能指標(biāo) ALT、AST、ALP及AST/ALT值均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。與DM組相比較，DM+RES組的AST、ALP及AST/ALT值均顯著下降(P<0.05)，ALT也有所下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，顯示肝損傷得到一定程度的改善；DM+NIA組的ALT、ALP及AST/ALT值繼續(xù)顯著升高(P<0.05；表3)，顯示肝損傷嚴(yán)重程度可能進(jìn)一步加大。與對(duì)照組相比，血清APN在DM組顯著降低(P<0.01)；與DM組相比較，DM+RES組的APN水平略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DM+NIA組血清APN水平顯著降低(P<0.05；表3)。

表1　定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

WISP-1: Wnt-induced secreted protein-1; AdipoR: adiponectin receptor; SIRT1: silent information regulator 1

2.4　光鏡檢查結(jié)果

與正常對(duì)照組大鼠相比較，DM組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)脂肪變性，肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，胞漿出現(xiàn)空泡化；DM+RES組大鼠肝臟脂肪變性減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀壞死亦減輕，細(xì)胞質(zhì)疏松化較輕；DM+NIA組大鼠肝臟細(xì)胞核被擠向細(xì)胞邊緣，肝細(xì)胞散在小泡性脂滴，肝竇不清晰，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹程度更高(圖1)。

2.5　4組大鼠AdipoR2、WISP-1和SIRT1表達(dá)變化

Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于正常對(duì)照組，DM組大鼠肝臟AdipoR2和SIRT1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，WISP-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與DM組相比較，DM+RES組AdipoR2和SIRT1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，WISP-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而DM+NIA組AdipoR2和SIRT1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，WISP-1蛋白表達(dá)具有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖2)。

DM大鼠各組與正常對(duì)照組大鼠肝臟組織AdipoR2、WISP-1及SIRT1 mRNA的表達(dá)均表現(xiàn)出差異，表達(dá)趨勢(shì)與蛋白表達(dá)基本一致。與對(duì)照組比較，AdipoR2和SIRT1 mRNA在DM組大鼠中表達(dá)顯著降低(P<0.01)，WISP-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與DM組比較，AdipoR2和SIRT1 mRNA在DM+RES組表達(dá)顯著增加(P<0.01)，WISP-1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)；而DM+NIA組AdipoR2表達(dá)顯著降低(P<0.05)，WISP-1 mRNA表達(dá)具有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SIRT1 mRNA表達(dá)有升高趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖3)。

3　討　論

APN是脂肪組織表達(dá)最豐富的基因產(chǎn)物之一，具有改善胰島素敏感性的作用，在機(jī)體脂質(zhì)代謝和血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控中具有重要作用[7]。APN作為體內(nèi)最重要的脂源性激素之一，在肝臟組織糖和脂肪代謝中起關(guān)鍵性作用[8,9]。AdipoR作為APN的特異性受體，在多種組織中廣泛分布，直接決定了APN效應(yīng)的發(fā)揮。AdipoR1和AdipoR2在肝臟組織中均有表達(dá)，但存在差異性。AdipoR2在肝細(xì)胞的高表達(dá)，確保了APN可以準(zhǔn)確有效地通過不同的受體形式發(fā)揮其反饋調(diào)節(jié)或改善糖脂代謝的作用[10]。研究表明[11]，有DM家族史而糖耐量正常的個(gè)體其肝組織AdipoR2的表達(dá)水平與DM病情具有相關(guān)性。WISP-1是Wnt通路的下游因子，當(dāng)其在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)異常積聚就會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄，最終抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究顯示[12]，作為Wnt通路下游的因子，WISP-1的表達(dá)受Wnt/β-catenin的調(diào)控。SIRT1參與DM多種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，可能是重要的調(diào)控因子。Wang等[4]研究顯示，SIRT1能夠通過調(diào)控WISP-1的表達(dá)來參與DM心肌病的發(fā)生發(fā)展過程，但在DM肝損傷中的研究卻未見報(bào)道。

表2　4組大鼠血生化指標(biāo)比較

FBG: fasting blood glucose; TC: total cholesterol; TG: triglycerides; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol. Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01; compared with DM group,#P<0.05,##P<0.01

表3　4組大鼠肝損傷指標(biāo)及血清APN水平比較

AST: aspartate amino transferase; ALT: alanine amino transferase; ALP: alkaline phosphatase; APN: adiponectin. Compared with control group,**P<0.01; compared with DM group,#P<0.05,##P<0.01

本實(shí)驗(yàn)研究DM狀態(tài)下，大鼠模型肝組織的病理生理變化與APN和WISP-1蛋白表達(dá)之間關(guān)系。研究顯示，在經(jīng)過驗(yàn)證的DM大鼠模型中，可見肝組織大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、變性及壞死，模型組APN水平降低，AdipoR2表達(dá)降低，WISP-1蛋白表達(dá)顯著升高；而當(dāng)給予SIRT1特異性激動(dòng)劑RES處理后，SIRT1蛋白表達(dá)顯著增加，APN水平升高，伴隨著AdipoR2表達(dá)也升高，WISP-1蛋白表達(dá)則降低。分析原因可能是由于SIRT1表達(dá)被激動(dòng)后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到抑制，導(dǎo)致下游WISP-1蛋白表達(dá)增加，WISP-1水平增高抑制了APN抵抗，而不斷緩解胰島素抵抗和所謂的“APN抵抗”相互影響，使APN促胰島素敏感性的作用不斷增強(qiáng)，形成肝損傷不斷緩解的良性循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)的肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，DM+RES組表現(xiàn)出炎細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死程度的減輕，也印證了這一點(diǎn)推斷。而在DM+NIA組，WISP-1表達(dá)升高，APN水平和AdipoR2表達(dá)降低，也反向印證了我們的推斷。

圖3　AdipoR2、WISP-1及SIRT1 mRNA在各組中的表達(dá)

AdipoR: adiponectin receptor; WISP-1: Wnt-induced secreted protein-1;SIRT1: silent information regulator 1. Compared with control group,**P<0.01; compared with DM group,#P<0.05,##P<0.01

DM肝損傷是DM的嚴(yán)重并發(fā)癥，內(nèi)分泌改變?cè)谠摬〉陌l(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究證實(shí)了在早期DM肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，SIRT1信號(hào)分子可能通過調(diào)節(jié)AdipoR的表達(dá)來調(diào)控APN的水平，參與DM內(nèi)分泌系統(tǒng)的病理生理演變，進(jìn)一步明確APN在DM肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中可能的機(jī)制及SIRT1因子在該機(jī)制中可能的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步闡明DM肝損傷的發(fā)生機(jī)制和尋找治療靶點(diǎn)提供了參考。

【參考文獻(xiàn)】