羅本華 郭雅雯 彭敏家 張亞飛 王 燕 覃斌寧

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

記憶減退、認(rèn)知障礙等為血管性癡呆(VD)核心癥狀。神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)估這種認(rèn)知功能的情況，“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸法是基于“三焦氣化失司理論”闡釋老年期癡呆的發(fā)病觀〔1〕、病機(jī)觀〔2〕及治療觀〔3〕，“益氣調(diào)血、扶本培元”針法多年臨床與實(shí)驗(yàn)研究〔4〕、取穴優(yōu)選組方〔5〕，結(jié)合特色的壯醫(yī)藥線灸刺激新創(chuàng)的一種老年期癡呆灸療新法；已取得其改善VD患者癥狀和認(rèn)知功能〔6，7〕的證據(jù)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其改善多發(fā)梗死性癡呆(MID)模型大鼠中樞海馬乙酰膽堿(ACh)、Ach酯酶(AChE)與膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)含量〔8〕的作用，提出其可能通過(guò)中樞ACh信息傳遞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用的假設(shè)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)觀察“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸法對(duì)MID大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 健康SPF級(jí)Wistar雄性大鼠100只，體重(280±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；室內(nèi)溫度18℃～22℃，相對(duì)濕度45%，室內(nèi)采光按照白晝循環(huán)模式，標(biāo)準(zhǔn)粒飼料定時(shí)喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)15 d。儀器為Eppendorf research plus單道可調(diào)整支消毒移液器(10 μl、200 μl及1 000 μl，編號(hào)：3120000)，12號(hào)彎錫灌胃針(GWL-12W)，TM-vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常組10只、假手術(shù)組10只和預(yù)用栓子造模組80只；栓子造模組在經(jīng)過(guò)MID造模成功53只入選，Morris水迷宮篩選，剔除不符合癡呆標(biāo)準(zhǔn)(8只)及死亡(5只)，最后入選40只，隨機(jī)分為模型組、藥線灸組、藥物組和藥線非穴組各10只。

1.3MID造模方法〔9〕取同種大鼠股動(dòng)脈采血，無(wú)菌條件下于37℃溫箱內(nèi)自然干燥24 h，用100目篩子過(guò)篩，制備200 μm以下的血凝塊備用。應(yīng)用時(shí)每10 mg血栓加0.3 ml生理鹽水制成混懸液。3.5%水合氯醛按35 mg/100 g體重腹腔麻醉。頸正中切開皮膚(約1 cm)，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸骨乳突肌，暴露頸外動(dòng)脈，分離頸外動(dòng)脈上兩分支，避開兩分支，分別在頸外動(dòng)脈上備2根手術(shù)縫合線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端先套一活結(jié)。用兒科4號(hào)頭皮針針頭逆行穿刺右頸外動(dòng)脈至右頸內(nèi)動(dòng)脈起始處，隨即用1 ml注射器緩慢(60～90 s)注入栓子鹽水懸液0.3 ml，使栓子通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動(dòng)脈，造成多灶性腦梗死，然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合皮膚。切口處滴注慶大霉素抗感染。假手術(shù)組手術(shù)方法同模型制作，只是注射時(shí)以生理鹽水0.3 ml代替栓子溶液。

1.4模型篩選 栓子造模組于造模后7 d進(jìn)行Morris水迷宮隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)，連續(xù)訓(xùn)練5 d，2次/d。取第5天正常組逃避潛伏期均值為參考值，同時(shí)計(jì)算栓子造模組第5天平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間的比值，該值>20%定為癡呆鼠。符合癡呆條件的動(dòng)物待用。

1.5干預(yù)方法及療程 干預(yù)方法：模型組給予藥線灸組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。藥物組于造模并癡呆篩選后將1 mg·kg-1·d-1鹽酸多奈哌齊溶于2 ml生理鹽水中灌胃，于每日早晨8：00灌胃。藥線灸組治則與取穴，與“益氣調(diào)血、扶本培元”針法相同。藥線灸操作方法：按《壯醫(yī)藥線灸療法》采用2號(hào)藥線(直徑0.5 mm)，輕刺激手法點(diǎn)灸，按“先上后下、先軀干再四肢、先陽(yáng)后陰：次序點(diǎn)灸以上相應(yīng)腧穴各1壯。藥線非穴組選取雙側(cè)肋下2個(gè)固定非穴點(diǎn)，針刺雙側(cè)肋下各兩個(gè)固定非穴點(diǎn)〔9〕，約相當(dāng)于乳正中線外開2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；作為對(duì)照刺激點(diǎn)，輕刺激手法藥線灸左3右4壯，或左4右3壯，交替。假手術(shù)組給予藥線灸組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。正常組給予藥線灸組相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。療程：各組每天做相應(yīng)處理1次，第8、16天各停1次，連續(xù)21次治療。

1.6行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方案測(cè)試 Morris水迷宮參照文獻(xiàn)制作〔10，11〕由圖像自動(dòng)采集和分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司，TM-vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng))自動(dòng)分析和處理，包括動(dòng)物的逃避潛伏期、游泳路徑、穿越原平臺(tái)的次數(shù)、游泳路線的長(zhǎng)度等參數(shù)。水迷宮實(shí)驗(yàn)方法與操作參考文獻(xiàn)〔11〕。除探索試驗(yàn)記錄大鼠在60 s內(nèi)外，其余每次水迷宮時(shí)間均設(shè)90 s。水迷宮實(shí)驗(yàn)在針刺等干預(yù)后次日進(jìn)行；實(shí)驗(yàn)程序包括第1～2天共2 d的隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)，第3天為探索試驗(yàn)，第4～6天共3 d反向試驗(yàn)及第7天的可視平臺(tái)試驗(yàn)。取每天兩次檢測(cè)的平均潛伏期時(shí)間均值為學(xué)習(xí)成績(jī)；以評(píng)價(jià)各組學(xué)習(xí)記憶能力變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析及組間兩兩比較，方差齊時(shí)選用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)選用DunnettT3法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1隱蔽平臺(tái)試驗(yàn) 模型組平均潛伏期下降緩慢而正常組下降明顯，于第2天，組間出現(xiàn)顯著性差異(P=0.016)；模型組平均潛伏期較正常組顯著長(zhǎng)，也較假手術(shù)組顯著長(zhǎng)，但假手術(shù)組與正常組無(wú)差異；藥線灸組較模型組、非穴組均明顯縮短，而藥物組沒有出現(xiàn)這種顯著性差異。見圖1和表1。

2.2反向試驗(yàn) 在連續(xù)3 d的反向試驗(yàn)中，正常組和模型組逃避潛伏期時(shí)間均隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸下

降，再學(xué)習(xí)成績(jī)穩(wěn)步提高，反映針刺治療和水迷宮的訓(xùn)練顯著性改善再學(xué)習(xí)和記憶作用(P<0.01)；訓(xùn)練天數(shù)與組間因素之間沒有交互作用(P>0.05)。各天組間因素兩兩比較發(fā)現(xiàn)：模型組平均逃避潛伏期時(shí)間下降緩慢而正常組下降顯著；第4天組間比較出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，模型組平均逃避潛伏期時(shí)間顯著高于正常組(P<0.01)和假手術(shù)組(P<0.05)，藥線灸組和藥物組均顯著性低于MID模型組(P<0.05)，而藥線灸組又顯著性低于非穴組(P<0.05)；此后2 d，第6天藥物組與模型組無(wú)顯著性差異，表現(xiàn)作用不穩(wěn)定，藥物組和藥線炙組無(wú)顯著性差異。見圖1和表1。

圖1 6組隱蔽、反向及可視平臺(tái)試驗(yàn)的平均逃避潛伏期趨勢(shì)

2.3空間探索試驗(yàn) 各組空間探索試驗(yàn)平均潛伏期有非常顯著性差異(P<0.01)。模型組比正常組穿越原平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)；藥物組雖較模型組能增加穿越原平臺(tái)次數(shù)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而藥線灸組穿越原象限平臺(tái)次數(shù)明顯增加，且分別比模型組、藥物組及非穴組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

2.4可視平臺(tái)試驗(yàn) 平均逃避潛伏期時(shí)間方面，6組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；平均運(yùn)動(dòng)速度方面，6組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表1。

表1 6組水迷宮中平均逃避潛伏期時(shí)間

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與藥線灸非穴組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；與藥物組比較：7)P<0.05

3 討 論

VD臨床以認(rèn)知功能障礙癥候?yàn)楹诵陌Y狀，兼有一些局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、神經(jīng)心理癥狀和精神行為異常。動(dòng)物研究常采用神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)這種認(rèn)知功能狀況。本實(shí)驗(yàn)提示各組大鼠在感覺或運(yùn)動(dòng)功能方面均無(wú)顯著差異，不對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生顯著性差異，提示該實(shí)驗(yàn)具有可比性。藥線灸法有療效優(yōu)勢(shì)。藥線灸方法較藥物治療是更合適和更優(yōu)選的方法，為進(jìn)一步深入可能的通過(guò)中樞ACh信息傳遞及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)制假說(shuō)研究提供了鋪墊；藥線灸方法是較西醫(yī)金標(biāo)準(zhǔn)藥物多奈哌齊治療是更佳和更適宜的方法，原因或與壯醫(yī)藥線灸法顯示的多途徑、多靶點(diǎn)和多層次作用有關(guān)，綜合改善VD認(rèn)知功能障礙作用是其取效的關(guān)鍵，這正是單一靶點(diǎn)金標(biāo)準(zhǔn)藥物所不具備的，多奈哌齊治療不可避免有其局限性、單一靶點(diǎn)性及副作用。

4 參考文獻(xiàn)

1羅本華，趙 嵐，成海燕，等.論老年期癡呆是生命氣化階段性異常病變〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(13)：3791-5.

2羅本華，成海燕，趙 嵐，等.論生命氣化階段性失常是衰老病機(jī)之長(zhǎng)〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2012；39(12)：2391-4.

3羅本華，于建春，成海燕，等.論三焦氣化是腦神的基礎(chǔ)〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2010；37(6)：1004-7.

4羅本華.“益氣調(diào)血、扶本調(diào)源”針法治療血管性癡呆研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(14)：4091-2.

5羅本華，張雪竹，趙 嵐，等.三種針法對(duì)快速老化癡呆模型小鼠老化評(píng)分及行為學(xué)影響研究〔J〕.環(huán)球中醫(yī)藥，2013；6(3)：165-71.

6羅本華，于建春，吳躍強(qiáng)，等.“益氣調(diào)血、扶本調(diào)源”藥線灸療法治療輕中度血管性癡呆30例〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014；34(11)：3134.

7羅本華，于建春，胡躍強(qiáng)，等.“益氣調(diào)血、扶本培源”藥線灸治療輕中度血管性癡呆臨床觀察〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015；26(3)：649-51.

8羅本華，羅梅桂，張亞飛，等.“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸對(duì)多發(fā)梗塞性癡呆大鼠海馬乙酰膽堿、乙酰膽堿脂酶與乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶含量影響的研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2016；37(8):4467-9.

9Liu CZ，Yu JC，Cheng HY，etal.Spatial memory performance and hippocampal neuron number in osteoporotic SAMP6 mice〔J〕.Exp Neurol，2006；201(2)：452-60.

10Morris R.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat〔J〕.Neurosci Meth，1984；11(1)：47-50.

11Yu J，Liu C，Zhang X，etal.Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats〔J〕.Physiol Behav，2005；86(4)：434-41.