寧 登 陳 勁 程 琪 劉秋夢(mèng) 李 雪 姜 立

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科，湖北 武漢 430030)

結(jié)腸癌為常見(jiàn)的消化道腫瘤，有著惡性率高、預(yù)后差、病死率高等特點(diǎn)，其發(fā)病和致死率在消化道腫瘤中居于前列〔1〕。結(jié)腸癌病情的嚴(yán)重程度與腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移、耐藥性密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，指上皮細(xì)胞在一定條件下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，能讓腫瘤細(xì)胞獲得并增強(qiáng)侵襲與轉(zhuǎn)移、耐藥性等能力〔2，3〕，嚴(yán)重影響結(jié)腸癌的臨床治療，顯著降低患者生活質(zhì)量和預(yù)后質(zhì)量。胸腺素β4(Tβ4)是一種小分子極性多肽，在細(xì)胞內(nèi)起著重要的作用，廣泛存在于生物體的各個(gè)組織之中。已有研究〔4〕表明，Tβ4過(guò)表達(dá)往往伴隨著E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)減弱與腫瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，即表現(xiàn)為促進(jìn)EMT。然而Tβ4促進(jìn)EMT的具體機(jī)制尚未明朗。整合素相連激酶(ILK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可與細(xì)胞內(nèi)許多骨架蛋白相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞黏附等。ILK在多種腫瘤細(xì)胞中均表達(dá)異常，ILK的高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ILK的表達(dá)受多種機(jī)制調(diào)節(jié)，而Tβ4是否可通過(guò)調(diào)節(jié)ILK表達(dá)從而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT表型及轉(zhuǎn)移能力尚不清楚。本研究采用過(guò)表達(dá)及沉默策略，結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR(qRFPCR)、Western印跡、免疫組化等多種分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞中Tβ4的表達(dá)改變是否會(huì)改變細(xì)胞ILK表達(dá)、EMT表型及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，為發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者的治療提供新的治療策略和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司，于37℃，5% CO2的條件中無(wú)菌培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的L-15細(xì)胞培養(yǎng)基(含200 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素)。L-15培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾公司。胎牛血清購(gòu)自Biological Industries公司。Taq2000 DNA聚合酶購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系篩選所用的G418購(gòu)自中科瑞泰公司。硝酸纖維素膜購(gòu)自頗爾公司。人E-cadherin單克隆抗體、人N-catenin單克隆抗體、人Akt多克隆抗體均購(gòu)自Cell Signal公司。人p-Akt(Ser473)單克隆抗體購(gòu)自上海信裕公司。人ILK單克隆抗體和人β-tubulin多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。所有其他生化試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2病例選擇 29例經(jīng)同濟(jì)醫(yī)院病理確診并手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織，均選取了癌組織中心、癌旁組織和遠(yuǎn)端正常黏膜組織為對(duì)照。病例術(shù)前均已接受一個(gè)療程的5-氟脲嘧啶(5-FU)加亞葉酸鈣(LV)聯(lián)合化療方案，但未接受放療。其中女7例，男22例。按結(jié)腸癌TNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)歸類(lèi)如下：Ⅰ期3例，Ⅱ期21例，Ⅲ期5例。標(biāo)本均用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.3Tβ4過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建及培養(yǎng) 在37℃、5%CO2環(huán)境下，將SW480細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)情況良好的數(shù)對(duì)細(xì)胞按3×105接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70%左右時(shí)，轉(zhuǎn)染帶G418抗性的Tβ4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒購(gòu)自維真生物公司，將Tβ4的CDS區(qū)序列克隆至pBK-CMV載體。將細(xì)胞分為兩組，分別轉(zhuǎn)染48 h、72 h，觀察Tβ4在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。以0.8 mg/ml濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng)2 w，4 w后獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，分別命名為T(mén)b3(轉(zhuǎn)染48 h)、Tb4(轉(zhuǎn)染72 h)。

1.4Tβ4干擾腺病毒的構(gòu)建及感染 將Tβ4基因與GFP DNA片段分別鏈接到pShuttle-CMV載體上，使用PmeⅠ線性化，再轉(zhuǎn)染至BJ5183細(xì)胞中。使用PacⅠ酶切斷后若出現(xiàn)3 kb或4.5 kb DNA片段，則證明轉(zhuǎn)染成功。獲得的腺病毒基因組經(jīng)PacⅠ酶線性化之后，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入Ad293細(xì)胞中。48 h之后，用反復(fù)凍融提取病毒，并繼續(xù)通過(guò)Ad293細(xì)胞擴(kuò)增。制備出足夠的病毒之后，在無(wú)血清的環(huán)境中感染細(xì)胞1 h。再將培養(yǎng)基置換成完全培養(yǎng)基，在標(biāo)準(zhǔn)條件中培養(yǎng)細(xì)胞。

1.5qRT-PCR 用Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA。按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明制備cDNA第一鏈，使用Taq2000 DNA 聚合酶按以下引物序列擴(kuò)增Tβ4，正向：5′-ATGTCTGACAAACCCGATATG-3′，反向：5′-GCTAGCCAGACCATCAGATG-3′。用SYRB Green染料(大連寶生物工程有限公司)法對(duì)mRNA水平進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。Tβ4定量引物正向：5′-ATGTCTGACAAACCCGATATG-3′，反向：5′-GCTAGCCAGACCATCAGATG-3′，內(nèi)參引物β-Actin序列如下：正向：TCATGAAGTGTGACGTGGACAT；反向：CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG。反應(yīng)采用兩步法，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)Bio-RADiCycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500)上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，10min；95℃，30s；60℃，1 min。重復(fù)第二步，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。病毒感染前后分別按說(shuō)明實(shí)時(shí)定量測(cè)量Tβ4基因的表達(dá)。將Tβ4與β-actin比值作為T(mén)β4表達(dá)水平的參數(shù)，進(jìn)行定量分析。每次測(cè)試重復(fù)3次。

1.6總蛋白、胞質(zhì)蛋白提取 總蛋白提取按照RIPA細(xì)胞裂解液操作流程裂解。參照說(shuō)明書(shū)操作，收集細(xì)胞；加入冰上預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞沉淀；離心后棄上清，稱量細(xì)胞質(zhì)量，根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦量加入冰預(yù)冷的CERⅠ溶液(含有蛋白酶抑制劑)，渦旋振蕩15 s重懸細(xì)胞，冰浴10 min；加入CERⅡ溶液，渦旋5 s后冰上孵育1 min，再渦旋震蕩5 s，4℃離心10 min，吸取上清即得到胞漿蛋白。

1.7Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 用聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，然后轉(zhuǎn)染硝酸纖維膜(NC膜)，室溫封閉1 h；4℃結(jié)合ILK、E-cadherin、β-cadherin、α-Parvin、GAPDH一抗過(guò)夜；TBST洗3次，每次10 min；室溫結(jié)合羊抗兔IgG-HRP為二抗1h；TBST洗3次，每次10 min ；ECL發(fā)光系統(tǒng)顯示蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.8Tβ4、ILK、E-cadherin的免疫組織化學(xué)染色法 石蠟包埋經(jīng)甲醛固定的樣本。切片，常規(guī)脫蠟至水。以Tβ4染色為例，以人多克隆Tβ4抗體為一抗(1∶200)，生物素標(biāo)記兔抗為二抗(1∶500)，加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)復(fù)合物。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，充分水洗后脫水，制片，隨機(jī)選取視野照相(奧林巴斯顯微鏡CX31)，免疫組織化學(xué)結(jié)果分析由染色強(qiáng)度(弱、中、強(qiáng)分別為1，2，3分)和陽(yáng)性染色百分比(<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分)兩者的評(píng)分乘積決定，小于4分為低表達(dá)，大于等于4分為高表達(dá)。ILK和 E-cadherin與此類(lèi)似。

2 結(jié) 果

2.1Tβ4促進(jìn)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT 本研究構(gòu)建了Tβ4過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并選取Tβ4表達(dá)最高的兩個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆命名為T(mén)b3和Tb4進(jìn)行后續(xù)研究。PCR結(jié)果顯示，與親本SW480細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載的對(duì)照細(xì)胞(BK)相比，Tb3和Tb4細(xì)胞中的Tβ4顯著升高(圖1)。形態(tài)學(xué)上，Tb3和Tb4細(xì)胞排列松散、無(wú)規(guī)律，呈游離樣分別；細(xì)胞輪廓呈拉長(zhǎng)紡錘形態(tài)，部分細(xì)胞伴有絲狀偽足形成(圖2)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，在Tb3與Tb4細(xì)胞中，E-cadherin顯著降低而N-catenin顯著上升(圖3)。

圖1 PCR方法檢測(cè)各細(xì)胞的Tβ4表達(dá)水平

圖2 Tb3、Tb4的形態(tài)(×400)

圖3 Western印跡檢測(cè)各細(xì)胞的E-cadherin、 N-catenin表達(dá)水平

2.2Tβ4過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中ILK表達(dá)及活性上升 在Tβ4過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，不論是全胞溶解產(chǎn)物(總蛋白，T)還是胞液部分(胞質(zhì)蛋白，C)之中，ILK的含量都較高，而α-Parvin的含量并無(wú)變化(圖4A)，p-Akt(Ser473)表達(dá)增強(qiáng)，提示ILK活性增加(圖4B)。見(jiàn)表1、表2。

A：采用Western印跡方法檢測(cè)各細(xì)胞的總ILK(T)、α-Parvin(T)及胞質(zhì)ILK(C)、α-Parvin(C)水平；B：采用Western印跡方法檢測(cè)各細(xì)胞的p-Akt(Ser473)、AKT水平圖4 Tβ4過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中ILK表達(dá)及活性上升

指標(biāo)SWBKTb3Tb4ILK(T)1.00±0.041.23±0.072.44±0.111)2)3.10±0.171)2)ILK(C)1.03±0.031.25±0.072.53±0.091)2)3.32±0.211)2)α-Parvin(T)1.01±0.040.56±0.050.84±0.071.05±0.04α-Parvin(C)1.03±0.050.55±0.070.53±0.061.28±0.05

與SW比較：1)P<0.05；與BK比較：2)P<0.05；表2同

表2 各細(xì)胞體外激活酶試驗(yàn)結(jié)果

2.3Tβ4過(guò)表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移 傷痕愈合和transwell方法結(jié)果顯示，Tβ4過(guò)表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)(圖5A)，侵襲能力也顯著升高(圖5B)。

2.4干擾Tβ4表達(dá)可下降細(xì)胞中ILK表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移 在Ad-Tβ4 AS感染24 h與48 h之后，Tβ4的表達(dá)顯著下降，而且，受Ad-Tβ4 AS感染的Tb3和Tb4細(xì)胞中，ILK也明顯下降，傷痕愈合、Transwell方法檢測(cè)抑制Tβ4后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力均顯著下降，見(jiàn)表3，圖6。

2.5在人結(jié)腸癌組織中Tβ4的表達(dá)水平與E-cadherin表達(dá)及ILK活性的相關(guān)性 本研究對(duì)29例結(jié)腸癌標(biāo)本采用免疫組化法檢測(cè)組織標(biāo)本中Tβ4，E-cadherin和ILK的表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖7，見(jiàn)表4。

Tβ4 mRNA相對(duì)量(%)0 h12 h24 h48 hILK相對(duì)表達(dá)量(%)48 h96 hTb3100.0±0.1103.1±11.249.2±5.61)48.3±2.01)0.50±0.020.48±0.01Tb4100.0±0.197.3±1.561.6±3.21)56.1±7.11)0.71±0.080.50±0.02

與0 h比較：1)P<0.05

圖7 采用免疫組化方法檢測(cè)組織標(biāo)本中Tβ4，E-cadherin和ILK的表達(dá)水平(DAB，×400)

Tβ4(+)(-)患者人數(shù)209ILK(+)16(80.0)0(0.0)ILK(-)4(20.0)9(100)E-cadherin(+)2(10.0)6(66.7)E-cadherin(-)18(90.0)3(33.3)

Tβ4的過(guò)表達(dá)與ILK的表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.035)，而與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.043)

3 討 論

EMT是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性、失去與基底膜的連接，從而獲得了較高的遷移與侵襲、降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。發(fā)生EMT的細(xì)胞其形態(tài)學(xué)上會(huì)發(fā)生顯著變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞極性喪失、出現(xiàn)紡錘形的成纖維樣的細(xì)胞形態(tài)，出現(xiàn)絲狀偽足。E-cadherin的表達(dá)降低或丟失是EMT的最重要的標(biāo)志性變化〔5〕。已有研究〔6～8〕證實(shí)，由E-cadherin表達(dá)降低引起的EMT，將減弱E-cadherin依賴性的胞間黏附作用，同時(shí)增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，加快腫瘤的惡性變化。

目前已證實(shí)，ILK的激活能夠下調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平，促進(jìn)EMT，從而引發(fā)腫瘤細(xì)胞的遷移與腫瘤的惡化〔9～11〕。同時(shí)，多項(xiàng)研究〔9，12～14〕表明，ILK激活的癌癥患者預(yù)后生存、生活質(zhì)量顯著降低。Tβ4是一種促淋巴細(xì)胞生成因子，廣泛存在于大多數(shù)組織和細(xì)胞中，參與了免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷愈合、組織再生等需要細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的生物過(guò)程〔15～17〕。本研究中，從統(tǒng)一的結(jié)腸癌細(xì)胞系中幾種穩(wěn)定的Tβ4過(guò)表達(dá)克隆系(Tb3和Tb4)的形態(tài)呈纖維狀、分散狀，提示這些細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)生了EMT。經(jīng)檢測(cè)，在這些新細(xì)胞中，E-cadherin的含量顯著降低，與之前類(lèi)似研究〔4〕的結(jié)果一致，對(duì)于Tb3和Tb4細(xì)胞來(lái)說(shuō)，無(wú)論是細(xì)胞整體還是胞質(zhì)的溶解產(chǎn)物中，檢測(cè)到N-catenin的含量顯著上升。由于N-catenin mRNA含量并沒(méi)有上升，這里的上升極有可能是由于其穩(wěn)定性提高。因?yàn)樵赥β4過(guò)表達(dá)的SW480細(xì)胞中，ILK蛋白的表達(dá)和ILK酶的活性升高，而相反的，作為ILK激活蛋白之一的α-parvin卻并沒(méi)有發(fā)生變化。這提示此處的ILK激活與其-parvin復(fù)合物無(wú)關(guān)。本研究隨后用攜帶Ad-Tβ4 AS的腺病毒感染了Tβ4過(guò)表達(dá)的細(xì)胞以抑制Tβ4，這些受感染的細(xì)胞中ILK活性明顯下降。更重要的是，免疫組化試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在人體結(jié)腸癌細(xì)胞中，Tβ4的表達(dá)水平與ILK呈正相關(guān)，與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，在人結(jié)腸癌細(xì)胞中，Tβ4相關(guān)的EMT與ILK的激活密不可分。這種作用不僅僅表現(xiàn)在破壞胞間連接，還表現(xiàn)為下調(diào)E-cadherin的表達(dá)。因此Tβ4的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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