李 海 楊 潔 陳建海 黃炳臣 黃海玲 王金花 方曉燕 黎 飚

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

老年性骨質(zhì)疏松(OP)中絕經(jīng)后OP(PMOP)發(fā)病率最高，臨床癥狀最重，與營養(yǎng)、種族、遺傳和年齡有關(guān)，PMOP的骨質(zhì)流失大于骨質(zhì)生成，與卵巢功能降低，女性激素水平下降，引起破骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)增加有關(guān)。山茶籽油內(nèi)含植物性雌激素〔1〕。研究表明骨質(zhì)流失與雌激素受體(ER)的不同基因型有關(guān)〔2〕。本課題擬探討ER-β不同基因型與山茶籽油相互作用對防治廣西百色壯族婦女PMOP的影響。

1 材料和方法

1.1對象 長期非食用山茶籽油(NECO)廣西百色壯族40～80歲婦女619人，長期食用山茶籽油(ECO)40～80歲婦女598人，排除肝、腎、肺、心及內(nèi)分泌等器官疾患，無摘除卵巢病史，也未服用激素等對骨代謝有影響藥物。檢測對象均無長時間外出經(jīng)歷，3代祖宗均屬純壯族。ECO組長期食用山茶籽油，極少食用其他植物油或動物油，而NECO組長期食用花生油或動物油。

1.2超聲骨密度測定 采用法國生產(chǎn)的超聲定量骨密度儀(QUS)檢測右側(cè)跟骨超聲寬帶衰減值(BUA)。每次測定前均由專門技術(shù)員開機進(jìn)行校對。按照我國OP臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，與廣西百色地區(qū)相關(guān)人群正常的骨峰值(PBM)比較BUA減少值≤2.0為正常組，>2.0為PMOP組。

1.3ER基因多態(tài)性測定

1.3.1設(shè)計和合成引物 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行引物設(shè)計〔3〕，ER-β基因擴增Rsa I位點上游引物：5′-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3′，下游引物：5′-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3′。特異性擴增ER-β基因Alu多態(tài)性相應(yīng)位點一段DNA引物的序列P1：5′-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3′，P2：5′-AATGAGGGACCACAGCA-3′，PCR終產(chǎn)物片段長度為307 bp。

1.3.2提取DNA模板 用碘化鈉(NaI)DNA提取法，取乙二胺四乙酸抗凝的全血100 μl加入滅菌雙蒸餾水100 μl進(jìn)行混勻，加入6 mol/L NaI 200 μl進(jìn)行渦旋震蕩30 s，再加入相等體積的異戊醇/氯仿(1∶24)進(jìn)行渦旋震蕩30 s，經(jīng)離心取其上清液再加入0.6倍體積的異丙醇并拌勻，4℃靜置15 min，經(jīng)離心沉淀后用70%乙醇洗滌1次，晾干物溶于TE緩沖液中，測定提取模板DNA后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3PCR擴增〔4〕反應(yīng)體系50 μl，其中內(nèi)含有10倍緩沖擴增液、dNTPs各200 μmol/L，引物P1和P2各0.4 μmol/L，DNA模板物0.1 μg。置于熱循環(huán)儀內(nèi)(Bio-Rad型，日本)中95℃預(yù)變性5 min，再注入Taq DNA聚合酶2.5 U。94℃變性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸45 s，72℃末次進(jìn)行延伸10 min，循環(huán)35次。

1.3.4擴增產(chǎn)物用限制性酶進(jìn)行酶切 取PCR擴增產(chǎn)物10 μl,用10 U Rsa Ⅰ、8 U Alu Ⅰ于37℃酶切3 h。酶切反應(yīng)終止的產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺電泳凝膠電泳，再進(jìn)行溴化乙啶(EB)染色，用DNA標(biāo)準(zhǔn)物的片段長度作為參照，燈光下觀察結(jié)果和拍色帶照片。

1.4統(tǒng)計處理 使用SSPS16.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1超聲骨質(zhì)密度測量結(jié)果 NECO組骨質(zhì)密度正常379例(61.2%)，PMOP 240例(38.8%)。ECO組骨質(zhì)密度正常419例(70.1%)，PMOP 179例(29.9%)。兩組PMOP發(fā)病率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2ER-β 基因型多態(tài)性分析 ER基因多態(tài)性采用Rsa Ⅰ酶進(jìn)行酶切可以區(qū)分出3個基因型：rr基因型(終產(chǎn)物為156 bp的1個條帶)，Rr基因型(終產(chǎn)物為156、125 bp的2個條帶)，RR基因型(終產(chǎn)物為125 bp的1個條帶)，見圖1；采用Alu Ⅰ酶進(jìn)行酶切可以區(qū)分出3個基因型：aa基因型(307 bp)，Aa基因型(307、240、67 bp的3個條帶)，AA基因型(240、67 bp的2個條帶)，見圖2。

圖1 ER-β Rsa Ⅰ酶切基因多態(tài)性的凝膠電泳圖譜

圖2 ER-β Alu Ⅰ酶切基因多態(tài)性的凝膠電泳圖譜

2.3正常組與PMOP組ER-β基因多態(tài)性比較 兩組ER-β的RsaⅠ酶切rr基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組ER-β AluⅠ酶切基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4ER-β Rsa Ⅰ酶切基因型多態(tài)性在ECO PMOP組與NECO PMOP組的分布比較 ECO PMOP組與NECO PMOP組 RR、Rr 和rr基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.5ER-β AluⅠ酶切基因型多態(tài)性在NECO PMOP組與ECO PMOP組的分布比較 ECO PMOP組攜帶Aa基因型頻率分布明顯少于NECO PMOP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表2 正常組和PMOP組ER-β RsaⅠ、ER-β Alu Ⅰ酶切基因型多態(tài)性分布比較〔n(%)〕

與對照組比較：1)P<0.01

表3 NECO組和ECO組ER-β Rsa I酶切基因型多態(tài)性分布比較〔n(%)〕

表4 NECO PMOP組和ECO PMOP組ER-β XbaⅠ酶切基因型頻率多態(tài)性分布比較〔n(%)〕

與ECO PMOP組比較：1)P<0.05

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查證實OP具有較強的遺傳性〔3〕，近年研究表明ER-β是OP密切相關(guān)基因之一〔4〕。Schuit等〔5〕研究說明ER-β基因多態(tài)性影響絕經(jīng)后婦女雌激素表達(dá)水平，而絕經(jīng)后婦女雌激素水平高低個體間有很大差異，在PMOP發(fā)生病理上起到?jīng)Q定性作用，因為雌激素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞形成骨質(zhì)，而抑制破骨細(xì)胞對骨質(zhì)溶解吸收，因此，ER-β基因的遺傳變異與PMOP密切相關(guān)。女性激素包括雌激素和孕激素，替代療法一般效果良好，但存在不良反應(yīng)特別是治療后的并發(fā)癥，如乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等。實驗證實植物性雌激素在體內(nèi)有雙向調(diào)節(jié)作用〔6〕。當(dāng)體內(nèi)雌二醇處于較低水平時，進(jìn)入體內(nèi)植物性雌激素可以轉(zhuǎn)化高活性雌激素發(fā)揮雌激素樣作用，當(dāng)體內(nèi)雌二醇處于較高水平時，進(jìn)入體內(nèi)植物性雌激素與受體相結(jié)合時起到抑制效應(yīng)。山茶籽油內(nèi)含的植物性雌激素對PMOP的實驗動物模型療效明顯〔1，7〕。

本研究結(jié)果表明，長期ECO有防治PMOP的作用，rr基因型更易患PMOP，帶有這種基因型婦女要提前做好PMOP的防治。Aa基因型是與山茶籽油起交互作用對PMOP有防治作用的敏感基因。內(nèi)含這種基因的絕經(jīng)婦女ECO對PMOP的防治效果最好。

4 參考文獻(xiàn)

1李 海,陳建海,王金花,等.山茶籽油對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥治療作用的實驗研究〔J〕.中國婦幼保健,2012;27(23):3646-9.

2Ascenzi P,Bocedi A,Marino M.Structure-function relationship of estrogen receptor alpha and beta:Impact on Human Health〔J〕.Mol Aspects Med,2006;27(4):299-402.

3Obemayer PB,Chararas C,kotschan S,etal.Genetic background of osteoporosis〔J〕.Acta Med Austriaca,2000;27(1):18.

4Ichikawa S,Koller DL,Peacock M,etal.Polymorphisms in the estrogen receptor beta(ESR2)gene are associataed with bone mineral density in Caucasian men and women〔J〕.J Clin Endocrinol Meta,2005;90(11):5921-7.

5Schuit SC,de Jong FH,Stolk L,etal.Estrogen receptor alphu gene polymorphisms are associated with estradiol levels in postmenop ausal uomen〔J〕.Eur Endocrinol,2005;153(2):327-34.

6巴文君,孫麗萍,張秋菊,等.補骨脂對初老小鼠體內(nèi)雌激素水平作用實驗研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報,2010;38(5):19-22.

7唐 玲，馮寶民，史麗潁，等.山茶屬植物的抗骨質(zhì)疏松作用〔J〕.中藥材，2008;31(10)：1540-4.