王艷杰，楊彥娟,康芯榮，孫陽，李明珠，劉旭，劉宏，代巧妹(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

臨床上在治療腫瘤患者時，多采用攻邪軟堅或健脾和胃法，有學(xué)者認為補益劑滋膩中焦，阻遏運化，不宜使用[1]。但近年來有大量研究表明一些補益劑在抗腫瘤實驗中能夠起到作用，包括當歸補血湯[2]。當歸補血湯是李東垣所創(chuàng)益氣補血名方,多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)當歸補血湯能夠在腫瘤放、化療中起到增效減毒的作用[3]，但鮮有研究表明單獨使用當歸補血湯具有抑瘤作用[4]。因此我們選用不同劑量的當歸補血湯，對S180荷瘤小鼠進行抗腫瘤研究，以了解其抑瘤作用的免疫學(xué)因素。

1 試劑、材料和儀器

1.1 藥物與試劑

當歸補血湯(黃芪90 g，當歸18 g)均購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局。采用傳統(tǒng)方法水煎煮108 g的生藥，兩次藥液混合，靜置2 h分層，取上層清液，與下層渾濁液離心后的上清液混合，濃縮至231 mL,約0.47g生藥/mL，留31 mL(作低劑量組)，余下繼續(xù)濃縮至100 mL，約0.94 g生藥/mL，留40 mL(作中劑量組)，余下濃縮至40 mL，約1.41 g生藥/mL(作高劑量組)。儲4 ℃?zhèn)溆?。環(huán)磷酰胺(CTX)(上海如吉生物科技有限公司，編號131011)。0.9%氯化鈉注射液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥準字H23020612)。95%乙醇(AR，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)。小鼠白介素2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 (武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.2 主要溶液的配制

PBS(現(xiàn)用現(xiàn)配)：A.稱取Na2HPO4·12H2O 35.81 g加500 mL蒸餾水，B.稱取NaH2PO4·2H2O 3.9 g加125 mL蒸餾水。量取A.385 mL+B.115 mL+ 500 mL生理鹽水混合均勻，即配成0.1 mol/L、pH7.3的磷酸鹽緩沖溶液。

1.3 實驗動物與瘤株

60只ICR雌雄各半小鼠(準字號：SCXK(黑)2013-004)，體質(zhì)量18～22 g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心供應(yīng)。S180細胞株：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫。

1.4 主要儀器

超凈工作臺HFsafe-1200(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平FA124(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；臺式離心機KA-1000(上海安亭科學(xué)儀器廠)；電熱鼓風干燥箱DGX-9143B-1(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司)；電熱恒溫水浴鍋HH·S11-2-Ⅱ(上海躍進醫(yī)療器械廠)； Infinite?M1000 Pro全波長多功能酶標儀(瑞士帝肯 ，Tecan)。

2 方法

2.1 造模方法

采用腹腔接種瘤株的昆明種小鼠，7 d傳代1次，經(jīng)過3次傳代后。選取接種7 d的小鼠5只，酒精局部消毒并抽取非溶血性腹水，共5 mL，生理鹽水稀釋、調(diào)整懸液濃度為1×106/mL，除正常組，以每只0.2 mL于其余50只小鼠右腋窩皮下消毒并接種。

2.2 分組及給藥

60只小鼠隨機分為正常組、陰性組、陽性(CTX)組(0.03 g/kg)、當歸補血湯高(14.04生藥/kg)、中(9.36 g生藥/kg)、低劑量組(4.68 g生藥/kg)。

接種瘤細胞后第2天開始給藥，陰性組每日生理鹽水灌胃0.2 mL/只；陽性組每只小鼠按0.03 g/kg隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺；當歸補血湯各組每日灌胃水煎劑0.2 mL/只。連續(xù)給藥10 d。

2.3 實驗記錄

末次給藥次日，稱體質(zhì)量，眼球取血待用，斷頸法處死各組小鼠，剝?nèi)×?、肝臟、脾臟并稱重記錄。計算體質(zhì)量的變化、抑瘤率及各臟器指數(shù)。計算公式如下：

抑瘤率(%)=(1-給藥組平均瘤量/造模組平均瘤重)×100%

臟器指數(shù)= 臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0進行數(shù)據(jù)處理。檢驗正態(tài)性，呈正態(tài)分布(若非正態(tài)分布用方法二)則用One-Way ANOVA方差分析，方差齊則用LSD-t進行組間比較(若方差不齊用方法二)。方法二：非正態(tài)分布或方差不齊的應(yīng)用多獨立樣本非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis Test)。P<0.05則差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 體質(zhì)量變化情況

各組小鼠在實驗后均有增加，陽性組增長最少，其余給藥組增長明顯。見表1。

表1 當歸補血湯對移植性S180荷瘤小鼠體質(zhì)量影響的比較

3.2 抑瘤率、移植瘤生長抑制率

與陰性組相比，給藥各組的瘤重均低于陰性組，且存在顯著性差異(P<0.01)；陽性組抑瘤率84.45%，其瘤重顯著低于其余給藥組(P<0.01)；當歸補血湯中、高組抑瘤效果(抑瘤率分別為均顯著高于低劑量組抑瘤效果P<0.01)，且中劑量組較高，但兩組無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 當歸補血湯對移植性S180荷瘤小鼠的瘤生長影響的比較

注：與陰性組比較，▲▲P<0.01；與陽性組比較，**P<0.01；與當歸補血湯高劑量組比較，##P<0.01

3.3 肝指數(shù)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，陰性組肝、脾指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與陰性組相比，陽性組肝、脾指數(shù)均顯著下降(P<0.01)；當歸補血湯各組肝、脾指數(shù)與陽性組相比顯著性升高(P<0.05)。見表3。

3.4 腫瘤細胞形態(tài)學(xué)的觀察

當歸補血湯各組瘤體經(jīng)固定后取出修整，流水沖洗12 h，放入包埋機經(jīng)徹夜脫水、透明，第二日即刻取出包埋、切片、展片、烘片后，再進行HE染色并封片，腫瘤組織切片即制作完成。

如圖1中所示，顯微鏡下觀察腫瘤組織，陰性組瘤細胞排列緊密，大量瘤細胞核質(zhì)色深呈多葉型、核質(zhì)比大，提示瘤細胞處于生長、分化旺盛階段。當歸補血湯組瘤細胞排列稀疏，核深染的瘤細胞占比隨給藥劑量加大而降低，組織內(nèi)出現(xiàn)破裂、空洞，部分區(qū)域被非瘤組織取而代之，低劑量組及陰性組有血管存在，高劑量組與中劑量組未見大量血管。

表3 當歸補血湯對移植性S180荷瘤小鼠免疫器官影響的比較

注：與正常組比較，##P<0.01；與陰性組比較，▲▲P<0.01；與陽性組比較，*P<0.05

圖1 腫瘤組織形態(tài)圖(10×40)

3.5 各組藥物對小鼠血清IL-2的影響

小鼠血液靜置2 h，3 000 r/min離心20 min，取上清液，使用相應(yīng)ELISA試劑盒按照說明書測定陰性組、當歸補血湯中、高劑量組血清中IL-2的濃度(由于低劑量組抑瘤率較低，只選擇兩個劑量組測試)。與陰性組相比，當歸補血湯中、高劑量組IL-2顯著性升高(P<0.01)見表4和圖2。

4 討論

當歸補血湯對S180荷瘤小鼠有抑瘤作用，從抑瘤率來看，隨著劑量增大，抑瘤率升高緩慢，以中劑量(9.36g生藥/kg)抑瘤率最高；從HE染色后的切片觀察結(jié)果來看，高劑量組腫瘤組織中浸入的炎性細胞、腫瘤細胞凋亡狀態(tài)較中劑量明顯。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有二：一是與操作者的瘤株剝離手法，導(dǎo)致瘤重的誤差；二是腫瘤切片的制備手法，導(dǎo)致切片斷面不同導(dǎo)致。

表4 當歸補血湯對移植性S180荷瘤小鼠細胞因子IL-2水平的影響比較

注：與陰性組比較，▲▲P<0.01

圖2 荷瘤小鼠血清IL-2標準曲線圖

當歸補血湯各組肝、脾指數(shù)均明顯升高，且與陰性組無顯著差異，表明當歸補血湯對免疫器官中免疫細胞具有活化作用，增強了免疫器官的防御能力。同時，當歸補血湯能促進免疫器官中的免疫細胞IL-2的分泌。IL-2是主要由活化的CD4+Th1細胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細胞因子，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，參與腫瘤監(jiān)視。IL-2也能夠促進淋巴細胞增殖，提高NK細胞活性，NK細胞又能促進IFN-γ分泌，而IFN-γ是抑制腫瘤細胞增殖的細胞因子。

綜合以上各種因素，可以推測當歸補血湯抗腫瘤作用是通過提高機體免疫器官的防御能力，活化免疫細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2，促進炎癥細胞浸潤入腫瘤組織，從而抑制腫瘤細胞的生長。這與已有報道稱當歸補血湯提取液能通過提高IL-2和IFN-γ來能增強CTL細胞毒效應(yīng)以抗腫瘤的作用是一致的[5]。

[1] 楊青青.對惡性腫瘤患者化療所致不良反應(yīng)的中醫(yī)護理[J].中國醫(yī)藥指南,2012,10(3):272-274.

[2] 李嬌,劉曉波.中藥在腫瘤治療中的減毒增效作用的研究進展[J].藥學(xué)研究,2015,34(4):229-231.

[3] 黃朝忠,劉智,蘇穎.當歸補血湯對腫瘤化療增效減毒作用的研究進展[J].吉林中醫(yī)藥,2014,34(9):962-964.

[4] 孫玉敏,宋福成,吳曉光.當歸補血湯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2006,6(9):31-32，35.

[5] 劉清君,胡敏棣,劉彩梅,等.超濾膜提取當歸補血湯對荷瘤小鼠脾細胞IL-2和IFN-γ的誘生作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008,29(4):472-474.