楊宋琪，韓梓霞，賴金霞，楊生輝，羅光宏

(河西學(xué)院，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅張掖 734000)

5-氨基乙酰丙酸(ALA)是卟啉、葉綠素及VB12等四吡咯生物合成的中間代謝產(chǎn)物[1]，具有多種生物活性[2]。20世紀(jì)末，Hotta等[3]發(fā)現(xiàn)外源ALA可以提高綠蘿(Epipremnumaureum)試管苗葉片光合速率，此后，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ALA在草莓、西瓜、白菜、蘿卜和煙草等高等植物上依然具有光合促進效應(yīng)[4-6]。尤其在植物處于低溫、弱光、高鹽度等脅迫條件下，ALA對植物光合作用促進效應(yīng)更為顯著[6-7]。汪良駒等[8]對蘿卜葉片研究表明，ALA處理有利于能量進入PSⅡ反應(yīng)中心，促進光化學(xué)效率提高；張春平等也發(fā)現(xiàn)，外源ALA能夠提高鹽脅迫下黃蓮葉片的電子傳遞效率，增大蘋果葉片在弱光脅迫下的光合效率，有效緩解逆境的對植物傷害[9-10]。截止目前，添加ALA提高植物抗逆性、增強光合能力的研究多集中在農(nóng)作物領(lǐng)域，但針對藻類的研究并不多見。然而，在規(guī)模化養(yǎng)殖過程中，藻類的生長及光合作用同樣受到低溫、弱光、鹽漬等因子的制約，進而導(dǎo)致養(yǎng)殖期限縮短、藻生物量積累效率低下等。因此，嘗試使用外源光合促進劑來提高藻類的光合效率十分必要。近年來，利用葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)技術(shù)檢測藻類光合系統(tǒng)對外界逆境環(huán)境因子的響應(yīng)已有一些研究[11]，但針對ALA對藻類抵御脅迫環(huán)境的研究尚鮮見報道。因此，筆者首次利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)來探究低溫條件下光合促進劑ALA對斜生柵藻熒光特性的影響，進一步了解ALA在藻類耐低溫方面的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)FACHB-416由中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫提供。5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽(aladdin)為白色粉末，純度99%，由上海晶純生化科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗處理及藻種培養(yǎng)

實驗處理溫度共設(shè)5、15和25 ℃3個梯度，ALA處理共設(shè)置空白對照組(CK)、一次性添加ALA組(ALA)和每3 d添加1次ALA組(C-ALA)3組處理，每次添加劑量均為5 mg/L，共組成9(3×3)個處理組合。將擴大培養(yǎng)至對數(shù)期的斜生柵藻分別接種至以上備好的150 mL含ALA新鮮的BG-11培養(yǎng)基中，每個處理3個平行重復(fù)，分別置于5、15和25 ℃條件下培養(yǎng)，光照50 μmol·m-2·s-1，光暗比12 h∶12 h，培養(yǎng)期間每天搖動藻液3～4次，共計培養(yǎng)12 d。

1.3 指標(biāo)的測定與方法

1.3.1斜生柵藻生長曲線及比生長速率每24 h分別取3 mL藻液于紫外-可見分光光度計(Harch-6000)上測定藻液在680 nm處的吸光度(OD680)，并記錄藻的生長狀況。

比生長速率(μ)計算公式為：

μmax=μmax(μ1,μ2,μ3, ...μn)

式中，μ表示斜生柵藻在某一時間段內(nèi)的比生長速率，μmax表示最大比生長速率，x2表示t2時間的藻類現(xiàn)存量，x1表示t1時間的藻類現(xiàn)存量。

1.3.2葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線(OJIP)及JIP-test參數(shù)取對數(shù)期藻液2.3 mL暗適應(yīng)20 min后，采用植物效率分析儀(英國漢莎科技有限公司)測定OJIP曲線及熒光參數(shù)，測定光強為3 000 μmol·m-2·s-1，最大激發(fā)波長650 nm，記錄10 μs到2 s葉綠素?zé)晒獾淖兓^程，從而準(zhǔn)確記錄OJIP等相[10]。參照孫永平等文獻[12]，設(shè)Fo為照光50 μs時熒光(O相)、Fk為300 μs時熒光(K相)、Fj為2 ms時熒光(J相)、Fi為30 ms時的熒光(I相)、Fm為最大熒光(P相)。用Fo-k、Fk-j、Fj-i和Fi-p分別表示放氧復(fù)合體(OEC)活性狀態(tài)、QA被還原能力、QB(含快還原PQ庫)被還原能力和慢還原PQ庫被還原的能力；其中，F(xiàn)o-k=(Fk-Fo)/Fo，F(xiàn)k-j=(Fj-Fk)/Fo，F(xiàn)j-i=(Fi-Fj)/Fo，F(xiàn)i-p=(Fm-Fi)/Fo。

同時，根據(jù)Strasser等[13]建立的高度簡化的能量流動理論模型，分析斜生柵藻PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動比活性能參數(shù)，包括單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)、t=0時單位反應(yīng)中心耗散掉的能量(DI0/RC)、t=0時單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量(TR0/RC)和t=0時單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ET0/RC)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進行單因素方差分析(One Way ANOVA)，并用LSD法進行多重比較，使用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 不同溫度下添加ALA對斜生柵藻的生長及比增長速率的影響

斜生柵藻在3個溫度條件下的生長和最大比生長速率結(jié)果(圖1)顯示，當(dāng)溫度為15 ℃和25 ℃時，隨著處理時間的增加，斜生柵藻的生物量顯著增加(P<0.05)；但在5 ℃條件下，斜生柵藻的生長極為緩慢，生物量增幅很小，與接種時差異不顯著(P>0.05)；處理期間，15 ℃和25 ℃低溫處理生物量始終明顯大于同期5 ℃低溫處理。待培養(yǎng)至穩(wěn)定期時(培養(yǎng)的第11～12天)，一次性添加ALA處理組的斜生柵藻生物量在3個溫度條件下均相對較高，但與相同低溫下的CK及C-ALA組相比均差異不顯著(P>0.05)。

同時，在5 ℃和15 ℃低溫處理下，斜生柵藻最大比生長速率(μmax)均表現(xiàn)為ALA組>C-ALA組>CK組；此時，ALA組μmax分別為(0.09±0.00)和(0.12±0.01) d-1，均顯著高于相應(yīng)CK和C-ALA組(P<0.05)，分別達(dá)到各自CK組的122.7%和126.8%。當(dāng)溫度為25 ℃時，斜生柵藻μmax在添加ALA后雖有一定程度的增長，但與對照相比均差異不顯著(P>0.05)。可見，添加ALA不同程度促進了斜生柵藻生長，并以一次性添加ALA效果更好，且在低溫5和15 ℃條件下表現(xiàn)得更突出。

2.2 ALA對不同溫度條件下斜生柵藻葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線的影響

由圖2可知，在3個溫度環(huán)境中，斜生柵藻相對可變熒光在CK組、ALA組和C-ALA組之間差異不顯著；但相比于25 ℃和15 ℃處理，斜生柵藻生長在5 ℃條件下受到嚴(yán)重的低溫脅迫，其OJIP曲線中出現(xiàn)K相。同時，用Fo-k、Fk-j、Fj-i、Fi-p分別表示氧氣釋放復(fù)合體(OEC)活性狀態(tài)、QA被還原能力、QB(含快還原PQ庫)被還原能力和慢還原PQ庫被還原的能力。結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，在5 ℃環(huán)境中，ALA組斜生柵藻Fo-k、Fk-j、Fj-i均顯著高于CK和C-ALA組(P<0.05)；而在15 ℃和25 ℃環(huán)境中， ALA組和C-ALA組斜生柵藻Fo-k、Fk-j、Fj-i均與CK組相近，即ALA的添加與否對斜生柵藻這幾個熒光參數(shù)的影響不大。

CK.對照，不添加ALA；ALA.一次性添加5 mg/L ALA；C-ALA.每隔3 d添加1次5 mg/L ALA；5、15和25分別表示5、15和25 ℃溫度處理；相同溫度下不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異；下同CK. Control, without ALA ；ALA. One-time spike with 5 mg/L ALA；C-ALA. Every-three-day spike with 5 mg/L ALA； 5, 15 and 25 represent 5, 15 and 25 ℃ treatments, respectively. The different normal letters within the same temperature indicate significant difference at 0.05 level; The same as below

2.3 ALA處理對不同溫度下斜生柵藻Fv/Fm和PIABS的影響

圖4顯示，在15 ℃和25 ℃溫度環(huán)境下，斜生柵藻PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)值均在0.70～0.75之間，且ALA、C-ALA和CK組之間差異均不顯著(P>0.05)；當(dāng)溫度為5 ℃時，斜生柵藻Fv/Fm值下降至0.4以下，且各組均顯著低于相應(yīng)的15和25 ℃處理組(P<0.05)。值得引起注意的是，在5 ℃低溫條件下，各添加ALA處理均使得斜生柵藻Fv/Fm值不同程度提高，且一次性添加處理還達(dá)到顯著水平。說明環(huán)境溫度越低，添加ALA對促進斜生柵藻抵抗低溫效果越顯著。

同時，PIABS表示以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)，反映PSⅡ整體的功能。圖4還顯示，隨著環(huán)境溫度降低，斜生柵藻PIABS在CK、ALA和C-ALA組均表現(xiàn)出逐漸顯著降低的趨勢(P<0.05)；與25 ℃處理相比，CK、ALA和C-ALA組斜生柵藻PIABS在5 ℃低溫處理中分別下降98.9%、98.4%和98.5%，它們在15 ℃處理中下降幅度較小，下降幅度分別為28.5%、26.1%和28.1%。在同一溫度處理下，斜生柵藻PIABS均表現(xiàn)為ALA組>C-ALA組>CK組。其中，在溫度為5 ℃環(huán)境下，ALA和C-ALA組斜生柵藻PIABS均比CK組獲得了顯著提升(P<0.05)；在15 ℃環(huán)境中，僅ALA組PIABS相比于CK組顯著增加(P<0.05)，而C-ALA組中PIABS雖有所增加但并未達(dá)到顯著水平；在25 ℃條件下，斜生柵藻PIABS在3個處理之間均差異不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果說明添加ALA對斜生柵藻PSⅡ光合效率的促進效果在溫度較低時更加明顯。

圖2 添加ALA后不同溫度下斜生柵藻OJIP曲線的變化Fig.2 Changes in the OJIP curves of S. obliquus treated with ALA at different temperature conditions

圖3 添加ALA后斜生柵藻熒光參數(shù)Fo-k、Fk-J、Fj-i、Fi-p的變化Fig.3 Changes in the chlorophyll fluorescence parameters Fo-k, Fk-j, Fj-i, Fi-p of S. obliquus treated with ALA at different temperature conditions

圖4 ALA對不同溫度下斜生柵藻Fv/Fm和PI ABS的影響Fig.4 Effect of ALA treatment on Fv/Fm and PIABS of S. obliquus under different temperature conditions

表1 添加ALA后3個溫度條件下斜生柵藻JIP-test參數(shù)的變化Table 1 Changes in the JIP-test parameters of of S. obliquus treated with ALA at different temperature conditions

2.4 ALA處理對不同溫度下斜生柵藻JIP-test參數(shù)的影響

在不同溫度處理條件下，添加ALA后斜生柵藻單位反應(yīng)中心吸收的光能(ABS/RC)、單位反應(yīng)中心捕獲的激發(fā)能用于還原QA的能量(TR0/RC)、單位反應(yīng)中心捕獲的光能用于電子傳遞的能量(ET0/RC)和單位反應(yīng)活性中心耗散掉的能量(DI0/RC)的變化情況如表1所示。在15 ℃和25 ℃條件下，兩種ALA添加方式處理的斜生柵藻ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC和DI0/RC與對照組相比均沒呈現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)；然而，當(dāng)溫度為5 ℃時，添加ALA處理的斜生柵藻ABS/RC和DI0/RC均顯著低于對照組(P<0.05)，而它們的ET0/RC和TR0/RC相比于對照組反而顯著增加(P<0.05)，但各參數(shù)在兩添加處理間無顯著差異。以上結(jié)果說明在15和25 ℃時，斜生柵藻PSⅡ反應(yīng)中心及電子供體側(cè)和受體側(cè)的生理狀態(tài)沒有因ALA的添加與否而呈現(xiàn)出顯著差異；但在5 ℃低溫時，斜生柵藻活性反應(yīng)中心負(fù)擔(dān)加重，耗能效率提高，最終導(dǎo)致光合能力的降低。

3 討 論

施用ALA使得農(nóng)作物耐弱光、低溫和鹽漬的能力獲得顯著提升，農(nóng)作物產(chǎn)量得到相應(yīng)提高[6, 9-10]。然而，關(guān)于ALA對藻類抗逆性機制的研究極為少見。Carothers研究發(fā)現(xiàn)，添加ALA能夠增強鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)光系統(tǒng)Ⅰ與光系統(tǒng)Ⅱ的活性，進而促進藻的生長[14]；李亞界研究發(fā)現(xiàn)，在25 ℃環(huán)境培養(yǎng)時，一定濃度范圍的ALA可明顯促進小球藻的生長，使得其生物量顯著提高[15]。然而本研究卻發(fā)現(xiàn)，在25 ℃環(huán)境條件下，ALA組和C-ALA組雖然使得斜生柵藻生物量和μmax略高于CK組，但差異不顯著(P>0.05)；但當(dāng)溫度為15 ℃和5 ℃時，ALA添加使得斜生柵藻μmax獲得了顯著提升(P<0.05)，分別達(dá)到各自對照組的122.7%和126.8%，暗示ALA能夠在一定程度上促進斜生柵藻的生長，且在低溫下促進作用更加顯著。

葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)可以快速、簡便、無損傷地檢測植物在逆境條件下光能的吸收、傳遞、能量耗散及光化學(xué)反應(yīng)等光合性能情況[16]。因此，該技術(shù)被形象地稱為植物光合作用研究的探針[17]。Strivastava研究表明，PSⅡ供體側(cè)受傷害時，水裂解系統(tǒng)及放氧復(fù)合體(OEC)受損，從而導(dǎo)致OJIP曲線K相(約300 ms處特征位點)出現(xiàn)，此時OJIP曲線則變?yōu)镺KJIP曲線[18]。本研究中斜生柵藻OJIP曲線測定結(jié)果顯示，5 ℃低溫使得斜生柵藻光系統(tǒng)遭受嚴(yán)重脅迫，OJIP曲線的K相出現(xiàn)，即低溫使得斜生柵藻OEC受損。同時，從Fo-k、Fk-j、Fj-i、Fi-p4個參數(shù)的計算結(jié)果來看，ALA組Fo-k、Fk--j、Fj-i、Fi-p僅在5 ℃時顯著高于CK組，又說明ALA處理使得斜生柵藻QA、QB被還原的能力以及PQ庫被慢還原的能力獲得顯著提升[12]。

PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)指所有PSⅡ反應(yīng)中心處于開放狀態(tài)時的量子產(chǎn)量，能反映PSⅡ的功能，該指標(biāo)在一般情況下較為穩(wěn)定，但當(dāng)處于脅迫環(huán)境時會顯著降低[19]。PIABS反映PSⅡ整體的功能，只要PSⅡ部分受到傷害，PIABS就能夠反映出來，在植物處于逆境中時，PIABS的反應(yīng)比Fv/Fm更為敏感，因而常用PIABS來快速篩選抗逆品種[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與25 ℃處理相比，斜生柵藻Fv/Fm和PIABS這兩個指標(biāo)在5 ℃的低溫條件下均急劇下降，而在15 ℃環(huán)境中斜生柵藻Fv/Fm值與25 ℃相近，但此時其PIABS值下降更為明顯。這一方面可以說明低溫脅迫會使得斜生柵藻光系統(tǒng)Ⅱ受限，另一方面說明PIABS比Fv/Fm能夠更加靈敏的檢測出斜生柵藻受低溫脅迫的程度。在同一溫度條件下，添加ALA對15 ℃和25 ℃條件下斜生柵藻的Fv/Fm和PIABS影響不大，卻使5 ℃環(huán)境下斜生柵藻Fv/Fm和PIABS均獲得了大幅提升。說明在一定溫度范圍內(nèi)，環(huán)境溫度越低，ALA對斜生柵藻PSⅡ保護作用越顯著，該結(jié)果與康瑯等研究結(jié)果一致[21]。

藻類PSⅡ反應(yīng)中心及電子供體側(cè)和受體側(cè)的生理狀態(tài)能夠通過JIP-test進行定量分析[20, 22]。本研究JIP-test結(jié)果顯示，環(huán)境溫度為15 ℃和25 ℃時，添加ALA對斜生柵藻JIP-test參數(shù)均沒有顯著影響；而在環(huán)境溫度為5 ℃時，ALA的添加使得斜生柵藻ABS/RC和DI0/RC顯著降低，ET0/RC和TR0/RC顯著增加?？梢?，低溫時ALA處理使得斜生柵藻單位反應(yīng)中心吸收的光能降低，熱耗散也減少，更多的能量通過電子傳遞鏈傳遞并參與光化學(xué)反應(yīng)，這一結(jié)論與孫永平等研究結(jié)果是一致的[12]，進一步說明了ALA在低溫下對斜生柵藻光系統(tǒng)的保護作用更為明顯。

另外，ALA在一定程度上可以促進斜生柵藻的生長，可能因為斜生柵藻生長與ALA濃度存在一定的劑量關(guān)系，使得連續(xù)添加組ALA對斜生柵藻生長的促進作用不夠明顯。截止目前，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ALA濃度對植物生長呈現(xiàn)先升后降的“N”形或“M”型曲線[15, 23]，其可能原因是ALA在低濃度時作為葉綠素合成前體物質(zhì)而促進光合作用，而在較高濃度時促進植物細(xì)胞呼吸作用降低細(xì)胞增長速率[3]。本研究發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，即連續(xù)添加ALA后斜生柵藻生物量與一次添加沒有顯著差異，且光合效率有所降低，生長效果相對較差。但即便如此，在較低溫度條件下，一次添加ALA處理斜生柵藻最大比生長速率依然獲得顯著提升，說明該物質(zhì)對斜生柵藻的促進作用具有一定潛力；葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)分析結(jié)果表明，在3個溫度環(huán)境中，溫度越低，ALA對斜生柵藻光合系統(tǒng)的保護作用越明顯。

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