郭海艷，劉 璐，孫宇蛟，沙彤蕓，王學征*

(1 農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱150030；2 東北農(nóng)業(yè)大學 園藝園林學院，哈爾濱150030; 3 東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，哈爾濱150030)

甜瓜(CucumismeloL.)是深受人們喜愛的一種水果型蔬菜，味道甜美，營養(yǎng)豐富，在世界各地均有種植。然而，枯萎病嚴重制約著中國甜瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此提高甜瓜枯萎病抗性迫在眉睫。防治甜瓜枯萎病最常用的方法是施用農(nóng)藥，但施用農(nóng)藥同時也對生態(tài)環(huán)境和人類生命安全構(gòu)成了一定的潛在威脅。水果農(nóng)藥殘留是影響其食用安全的重要因素之一，農(nóng)藥最高殘留限量也成為國際上各貿(mào)易國之間重要的技術(shù)壁壘[1]。因此，切實提高甜瓜自身抗病性是防治甜瓜枯萎病最環(huán)保有效的方式。

甜瓜枯萎病抗性相關(guān)基因有Fom-2、CHT、cab-1和Prv2等[2]。Fom-2在1973年被Risser研究發(fā)現(xiàn)，抗枯萎病生理 小種 0 和 1 感 生理小種2，由Silberstein 等在2003 年用分子標記將此基因定位在甜瓜遺傳圖譜上，直到 2004 年 Tarek分離克隆了甜瓜抗尖鐮孢枯萎病菌的Fom-2基因,并驗證其對該病菌的 0 和 1 型 生理小種有?；剐訹2]。目前為止此基因是世界公認的甜瓜抗枯萎病基因。

CHT為幾丁質(zhì)酶基因，能夠調(diào)控幾丁質(zhì)酶的含量，幾丁質(zhì)酶對立枯絲核菌等20多種病原真菌和非病原真菌的菌絲生長或孢子萌發(fā)具有抑制作用。除抗真菌外,幾丁質(zhì)酶對細菌、昆蟲、螨等也表現(xiàn)出一定抗性[3]，Schlumbaum A等[4]最先研究發(fā)現(xiàn),菜豆積累的幾丁質(zhì)酶經(jīng)過提純,在體外能夠強烈地抑制綠色木霉(Trichodermaviride)菌絲的生長。Marchant R等[5]利用基因槍法,將一種水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入感薔薇黑斑病的薔薇Glad Tidings品種中,結(jié)果該轉(zhuǎn)基因薔薇使黑斑病的嚴重度降低了13%～43%。

研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯[4-6]、水楊酸[7]、鈣離子在調(diào)控植物生長發(fā)育、抗逆、抗病反應方面都具有重要作用。茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是高等植物體內(nèi)天然存在的生長調(diào)節(jié)因子，外源 MeJA處理能夠誘導黃瓜[8-9]、玉米[10]、水稻[11]等作物的抗病性。研究表明，外源MeJA處理能夠誘導果實中抗病基因的表達、提高防御酶的活性、活化次生代謝途徑等[8,12-14]。張智慧等[15]使用外源MeJA顯著減輕了抗性水稻的稻瘟病害，賓金華等[16]證明MeJA處理煙草幼苗不僅可以提高幼苗抗炭疽病的能力,同時顯著上調(diào)PR-1、PR-2、PR-5和TA-JA2等抗性基因的表達量，向妙蓮等[17]研究表明MeJA浸種可有效減輕水稻幼苗白葉枯病的發(fā)生。

水楊酸(salicylic acid，即SA)為鄰羥基苯甲酸，在植物體內(nèi)合成，含量很低，可以在韌皮部運輸，并起著獨特的作用，是一種新的植物內(nèi)源激素[7]。SA能夠加速被侵染部位細胞的死亡，誘導系統(tǒng)抗性產(chǎn)生，誘導某些抗性基因及抗性相關(guān)蛋白的表達，進而影響植株的某些抗性生理反應。范存斐等[18]研究表明，采后水楊酸處理能夠通過誘導厚皮甜瓜的苯丙烷代謝增強果實對采后病害的抗性。曾凱芳等[19]認為，SA處理能顯著抑制果實病斑擴展,有效降低果實的接種發(fā)病率, 提高綠熟芒果對炭疽病的抗病性。

本實驗以甜瓜抗枯萎病品種MR-1、感枯萎病品種M1-15為試驗材料，應用SA、MeJA和Ca2+作為外源誘導劑，無菌水作為對照。采用熒光定量PCR技術(shù)分析抗病相關(guān)基因Fom-2、CHT的差異表達，試圖通過誘導提高甜瓜抗病基因Fom-2、CHT的表達水平來防御甜瓜枯萎病菌侵染，以期找到防治甜瓜枯萎病的高效新方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甜瓜枯萎菌(Fusariumoxysporumf.sp.melonis)生理小種Race 1由東北農(nóng)業(yè)大學西甜瓜分子育種實驗室分離、鑒定、保存?？箍菸√鸸掀贩NMR-1、感枯萎病甜瓜品種M1-15種子由東北農(nóng)業(yè)大學西甜瓜分子育種實驗室提供。PDA培養(yǎng)基組分： 馬鈴薯400 g，葡萄糖40 g，瓊脂40 g，蒸餾水2 L[20]。Armstrong培養(yǎng)基組分：葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 L，KH2PO41.1 g， KCl 1.6 g，ZnSO40.2 mg，Ca(NO3)25.9 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，F(xiàn)eCl30.2 mg[21]。反轉(zhuǎn)錄試劑盒由全式金公司提供，熒光定量PCR引物由上海生工合成。

1.2 外源誘導及病原菌接種

1.2.1甜瓜枯萎病菌培養(yǎng)利用 PAD培養(yǎng)基活化病原菌，接種于Armstrong培養(yǎng)基上，震動培養(yǎng)2～3 d(28 ℃、120 r/min)。取出后，用4層無菌紗布過濾培養(yǎng)液，再用無菌水稀釋，制成孢子懸浮液。鏡檢，孢子濃度為1×106個孢子/mL[22]。

1.2.2種子處理選取飽滿無傷甜瓜種子，進行常規(guī)消毒，經(jīng)25～28 ℃恒溫催芽，待露白后播種于經(jīng)過121 ℃高溫高壓滅菌2 h的育苗土中，待2片真葉時進行外源誘導處理。

1.2.3幼苗處理根據(jù)前期試驗[23]選出的最適濃度為1 mmol/L SA、1.2 mmol/L MeJA、220 mg/L Ca2+分別噴施處理甜瓜幼苗，每個處理10株苗，3次重復，無菌水作為對照。在噴施2 d后接種甜瓜枯萎菌，扣小棚保持溫度在25～28 ℃，相對濕度大于90%，保溫保濕5 d后，觀察發(fā)病情況，進行病情調(diào)查，計算病情指數(shù)。分別于接種后1、3、5、7、9 d取甜瓜葉片，測定相關(guān)抗性基因表達量的變化。

1.2.4葉片病情分級甜瓜枯萎病病情分級參照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準》中的相關(guān)規(guī)程。病情分級標準為：0級，無病癥；1級，子葉萎蔫或部分子葉與真葉輕微萎蔫；2級，1片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫；3級，子葉及部分真葉萎蔫；4級，整株輕度萎蔫，部分枯死；5級，整株嚴重萎蔫并枯死。病情指數(shù)計算公式為：病情指數(shù)(%)=∑(級別×株數(shù))/(總株數(shù)×最高代表級數(shù))×100。

1.3 Fom-2、CHT基因差異表達分析

甜瓜葉片總RNA的提取采用改進的Trizol法[24]，在液氮條件下，將樣品研磨成粉末，取50～100 g粉末樣品加入預先裝有1 mL Trizol 試劑的離心管中，充分振蕩15 s，充分乳化后，在室溫下靜置5 min。加入200 μL氯仿，充分振蕩15 s，充分乳化后，常溫下靜置2～3 min。于4 ℃下，12 000 r條件下離心15 min。取上層清液，加入等體積異丙醇。顛倒混勻，-20 ℃冰箱靜置10 min。在管壁出現(xiàn)膠狀沉淀，即為RNA。于4 ℃下，12 000 r離心10 min，棄去上清。向沉淀中加入1 mL 75%DEPC乙醇，緩慢地沿管壁加入，輕輕上下顛倒洗滌離心管壁。于4 ℃下，7 500 r離心5 min，棄去上清，重復一次。在超凈工作臺將RNA樣品晾干3～10 min，不可以離心或者加熱。干燥后加入50 μL的DEPC水溶解RNA，置于-80 ℃保存。

以總 RNA 為模板，按照由全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。實時熒光定量PCR目標基因Fom-2、CHT和內(nèi)參基因Cm-Actin的擴增引物由上海生工合成(表1)。熒光定量PCR總體系20 μL：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，1 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL，8.2 μL水。反應程序為：94 ℃預變性 30 s， 94 ℃變性 5 s，50 ℃退火 15 s，72 ℃延伸10 s， 40個循環(huán)。每個樣品重復3次，反應結(jié)束后，進行溶解曲線分析。

1.4 甜瓜的病情指數(shù)與抗病基因的相關(guān)性分析

分別記錄抗病甜瓜和感病甜瓜在幾種外源誘導劑預處理后不同時期病情指數(shù)與其相應時期的Fom-2和CHT基因表達量。使用SPSS22.0軟件進行相關(guān)性分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2015進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS22.0軟件進行差異顯著性分析，2-ΔΔCT法[25]進行基因表達相對變化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源預處理對接種后2品種病情指數(shù)的影響

不同抗感甜瓜品種MR-1、M1-15在外源預處理后，枯萎病病情指數(shù)均有不同程度降低(表2)，不同時間和不同外源預處理對甜瓜枯萎病的誘導效果不同(圖1)，總體表現(xiàn)出一定的時間效應。其中，MeJA和SA處理下的病情指數(shù)顯著低于對照，且隨著處理時間延長，病情指數(shù)呈下降趨勢，表明MeJA和SA具有提高甜瓜枯萎病抗性的作用。而Ca2+處理后，植株的病情指數(shù)與對照無顯著差異，誘導效果不明顯。

表1 擴增引物序列Table1 Target gene sequences of primers

表2 外源預處理對甜瓜枯萎病病情指數(shù)的影響Table 2 Effect of different treatments on Fusarium wilt disease index in melon

A.抗病甜瓜品種(MR-1)；B.感病甜瓜品種(M1-15);CK.接種枯萎病(對照)； MeJA.外源MeJA預處理后接種甜瓜枯萎病;SA. 外源SA預處理后接種枯萎病; Ca2+.外源Ca2+預處理后接種枯萎病A. Resistant melon(MR-1); B. Susceptible melon (M1-15); CK. Inoculation blight control； MeJA. Inoculation of melon wilt after pretreatment with exogenous MeJA; SA. Inoculation of fusarium wilt after exogenous SA pretreatment; Ca2+. Inoculation of fusarium wilt after pretreatment with exogenous Ca2+

2.2 甜瓜葉片總RNA提取

使用Trizol法提取甜瓜葉片中總RNA，其凝膠電泳如圖2，28S和18S帶型清晰，沒有拖帶現(xiàn)象，5S帶較淺，總RNA完整性較好?？梢苑崔D(zhuǎn)錄，進行定量分析。

2.3 外源預處理誘導下甜瓜葉片F(xiàn)om-2基因表達分析

經(jīng)外源誘導處理后，抗病甜瓜品種MR-1植株葉片中Fom-2基因出現(xiàn)差異表達，如圖3所示，接種后1、3和5 d時，MeJA和SA處理的植株葉片中Fom-2基因表達均顯著高于Ca2+處理和對照，1和5 d時Ca2+處理與對照無顯著差異，3 d 時Ca2+處理顯著低于對照；接種后的7～9 d，MeJA處理的葉片中Fom-2基因表達顯著高于其他3個處理，SA處理顯著高于Ca2+處理和對照，7 d時Ca2+處理顯著低于對照，9 d時Ca2+處理與對照無顯著差異；MeJA和SA處理后，接種9 d時葉片中Fom-2基因表達整體呈先上升再下降趨勢，分別在7、5 d時達到峰值，且均顯著高于其他時期，是其他時期的1.41～11.02倍和2.89～9.589倍，接種Ca2+處理和對照組均整體呈平緩趨勢。

1、2、3分別表示甜瓜材料葉片總RNA1, 2 and 3 indicate total RNA of melon leaf

不同大寫字母表示同一處理不同時間的差異顯著(P≤0.05)；不同小寫字母表示同一時間不同處理間差異顯著(P≤0.05)；下同The different capital letters indicate significant differences in the same treatment at different times (P≤0.05);The different normal letters indicate significant differences between different treatments at the same time (P≤0.05); Same as below

經(jīng)外源誘導處理后，感病甜瓜品種M1-15植株葉片中Fom-2基因出現(xiàn)差異表達。如圖4所示，接種后所有時期，MeJA處理的葉片中Fom-2基因表達顯著高于其他3個處理，SA處理顯著高于Ca2+處理和對照，Ca2+處理與對照無顯著差異。MeJA和SA處理后，接種9 d時葉片中Fom-2基因的表達整體呈上升趨勢，均在9 d時達到峰值，且顯著高于其他時期，分別是其他時期的3.88～8.9倍和1.99～6.5倍；Ca2+處理和對照組均整體呈平緩趨勢，7～9 d時Ca2+處理的Fom-2基因的表達急劇上升，達到峰值，顯著高于其他時期，是其他時期的1.72～2.62倍。

結(jié)果表明，不同外源誘導后抗病品種MR-1、感病品種M1-15中Fom-2基因均出現(xiàn)差異表達。其中，SA、MeJA可以誘導其上調(diào)表達，而Ca2+誘導其上調(diào)表達無顯著效果。

2.4 外源預處理誘導下甜瓜葉片CHT基因表達量分析

經(jīng)不同外源誘導處理下，抗病甜瓜MR-1葉片中CHT基因表達出現(xiàn)不同變化，如圖5所示：接種后1、3和5 d，MeJA和SA處理葉片中CHT基因表達均顯著高于Ca2+處理和對照，1、5 d時Ca2+處理與對照無顯著差異，3 d 時Ca2+處理顯著低于對照；接種后7～9 d，MeJA處理的葉片中CHT基因的表達顯著高于其他3個處理，SA處理顯著高于Ca2+處理和對照，7 d時Ca2+處理顯著高于對照，9 d時Ca2+處理與對照無顯著差異； MeJA處理后，接種9 d內(nèi)葉片中CHT基因表達整體呈先上升再下降再上升趨勢，3 d時達到第一個峰值，顯著高于其他時期，是其他時期的0.21～6.32倍，7 d時達到第二個峰值，顯著高于1、3、5 d三個時期；SA處理后，接種9 d內(nèi)整體呈上升趨勢，7 d時達到峰值，顯著高于其他時期，是其他時期的2.32～22.19倍， Ca2+處理和對照組均整體呈平緩趨勢。

圖4 不同誘導預處理對接種后感病甜瓜M1-15葉片中的Fom-2 基因表達的影響Fig.4 Effect of different induced pretreatments on the expression of Fom-2 gene in Muskmelon M1-15 leaves post inoculation

經(jīng)不同外源處理誘導后，感病甜瓜M1-15植株葉片中CHT基因表達出現(xiàn)不同變化，如圖6所示：接種后所有時期，MeJA處理的植株葉片中CHT基因表達顯著高于其他3個處理，SA處理顯著高于Ca2+處理和對照，1、3、5 d時Ca2+處理與對照無顯著差異，3 d時Ca2+處理顯著低于對照，7 d時Ca2+處理顯著高于對照。MeJA和SA處理后，接種9 d時葉片中CHT基因表達整體呈上升趨勢，分別在9、7 d時達到峰值，且均顯著高于其他時期，分別是是其他時期的2.66～12.45倍和1.90～10.60倍， Ca2+處理和對照組均整體呈平緩趨勢，7～9 d時Ca2+處理CHT基因表達急劇上升，達到峰值，顯著高于其他時期，是其他時期的0.94～1.90倍。

圖5 不同誘導預處理對接種后甜瓜MR-1葉片中的CHT基因表達的影響Fig.5 Effect of different induced pretreatments on the expression of CHT gene in Muskmelon MR-1 leaves post inoculation

圖6 不同誘導預處理對接種后甜瓜M1-15葉片=中的CHT基因表達的影響Fig.6 Effect of different induced pretreatments on the expression of CHT gene in Muskmelon M1-15 leaves post inoculation

結(jié)果顯示：SA、MeJA可誘導甜瓜抗病品種MR-1和感病品種M1-15葉片中的CHT基因上調(diào)表達，而Ca2+對CHT基因上調(diào)表達無顯著作用。

2.5 外源預處理后接種的甜瓜抗病性與基因表達的相關(guān)分析

如表3所示：抗病甜瓜MR-1的病情指數(shù)與Fom-2和CHT表達均呈極顯著性負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.926和-0.552；感病甜瓜M1-15的病情指數(shù)與Fom-2和CHT表達均呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.739和-0.734；表明Fom-2和CHT基因表達均與甜瓜的抗病性極顯著相關(guān)，因此通過外源誘導提高甜瓜的Fom-2和CHT表達量能夠提高甜瓜的抗病性。

3 討 論

甜瓜枯萎病是甜瓜主要病害之一，嚴重制約著甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，目前甜瓜枯萎病的研究主要集中在抗性基因上，利用分子選擇育種技術(shù)發(fā)現(xiàn)與甜瓜抗枯萎病相關(guān)的基因有Fom-2、CHT、cab-1和Prv2等，通過相關(guān)抗病基因的研究，揭示了甜瓜抗病的內(nèi)在調(diào)控機理，但目前通過施用外源物質(zhì)提高調(diào)控基因表達量來提高甜瓜抗病性鮮有研究。本實驗結(jié)果

表3 抗病甜瓜(MR-1)和感病甜瓜(M1-15)病情指數(shù)與基因表達的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of disease index and gene expression in disease-resistant muskmelon (MR-1) and susceptible melon (M1-15)

表明：接種甜瓜枯萎病菌后，抗病甜瓜和感病甜瓜的抗病基因Fom-2、CHT的表達均與甜瓜的病情指數(shù)呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，提高Fom-2、CHT的表達能夠有效提高甜瓜的抗枯萎病能力。

前人研究表明，SA誘導過程中為過氧化氫酶提供一個電子，使其進行過氧化反應，自身被轉(zhuǎn)變?yōu)樘幱谘趸瘧B(tài)的自由基，由SA自由基細胞脂質(zhì)進行攻擊，誘導脂質(zhì)過氧化物啟動各種抗病反應[26-27]。也有研究認為，SA通過在調(diào)控基因水平轉(zhuǎn)錄，完成誘導植物對生物脅迫產(chǎn)生抗性過程[28]，本實驗研發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SA預處理誘導后接種的抗、感病甜瓜品種均在實驗期抗間枯萎病基因Fom-2、CHT的表達量整體高于對照，且病情指數(shù)顯著低于對照組，說明施用外源誘導劑SA能夠有效提高甜瓜抗病能力，結(jié)果與任春林等[29]對白樺樹的研究結(jié)果一致。

前人研究表明，MeJA一方面促進植物葉片中纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)的合成，使細胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，阻礙病原菌的侵入；另一方面，誘導一些低分子量酚類前體的合成，在多聚作用時產(chǎn)生游離基，以鈍化病菌毒害作用[30-31]。另外，MeJA活化基因表達，產(chǎn)生抗病蛋白來抵抗病原菌，是啟動細胞保衛(wèi)系統(tǒng)的信號分子之一[32]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MeJA誘導預處理后接種，抗感病甜瓜在實驗期間抗枯萎病基因Fom-2、CHT表達量有所變化，但總體上顯著高于對照，且病情指數(shù)顯著低于對照組。說明施用外源誘導劑MeJA能夠有效提高甜瓜抗枯萎病病能力。結(jié)果與Benedetti 等對擬南芥的研究結(jié)果一致[33]

綜上所述：外源MeJA和SA預處理具有能夠提高甜瓜抗枯萎病基因Fom-2、CHT的表達量，進而提高甜瓜的抗枯萎病能力的功效；而Ca2+沒有提高抗病性的效果。這一結(jié)果豐富了甜瓜枯萎病的防治技術(shù)途徑，為減少農(nóng)藥防治污染提供了新的思路。

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