邱瑾麗，李紅嬌，張崇威

(1.鄭州福源動物藥業(yè)有限公司，鄭州 450001；2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

鹽酸土霉素為四環(huán)素類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用，且具有促進生長的作用，因此，在臨床上常用于治療豬、雞敏感大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及支原體引起的感染性疾病[1]。我國農(nóng)業(yè)部對四環(huán)素類抗生素在可食性動物組織中的最高殘留限量規(guī)定為：肌肉100 μg/kg，肝臟300 μg/kg[2]，美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定動物肌肉中四環(huán)素類藥物總量為200 μg/kg[3]。國內外對土霉素的殘留分析方法的研究較多，目前主要使用的有微生物檢測法，固相萃取-高效液相色譜法，液相色譜-串聯(lián)質譜法和放射免疫法[4-7]等。本試驗采用的是國家標準規(guī)定動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量的檢測方法[8]。雖然國內外很多研究報道了土霉素在肉雞肌肉和肝臟中的殘留消除規(guī)律，確定了土霉素的休藥期，但主要研究針對土霉素預混劑和拌料的給藥途徑。在實際養(yǎng)殖過程中，可溶性粉劑由于飲水給藥的便利和藥物更易均勻分布，使用范圍更廣泛。關于鹽酸土霉素可溶性粉對肉雞飲水給藥后，在肌肉、肝臟和雞胗的殘留消除規(guī)律研究尚未見報道。本試驗通過對鹽酸土霉素可溶性粉在肉雞體內殘留消除的研究，計算土霉素在不同組織中的休藥時間，以期為安全用藥和正確執(zhí)行休藥期提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試試劑 土霉素對照品，批號：130305，中國食品藥品檢定研究院；鹽酸土霉素可溶性粉，規(guī)格：50%，生產(chǎn)批號：201605003，鄭州福源動物藥業(yè)有限公司蘇可樂；甲醇，乙腈為色譜純；乙二胺四乙酸二鈉為分析純，超純水，所需溶液配制見GB/T 21317[8]。

1.2 主要儀器 Acquit UPLC-Xevo TQ-S質譜聯(lián)用儀，美國Waters 公司；3K-30臺式高速冷凍離心機，Sigma公司；R215 Professional旋轉蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；IKAMS3.Basic圓周振蕩器，廣州儀科實驗室技術有限公司；ALC-2100.2，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器，北京踏錦科技有限公司；TTL-DC Ⅱ氮氣吹干儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；TD系列固相萃取柱，TD-TPS-00603，天津市天興達科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗動物 三組肉雞，購自山西省陽城縣浩博養(yǎng)殖有限公司，隨機分為對照組26日齡，10000只；常規(guī)劑量組25日齡，16300只；加大劑量組32日齡，12000只。飼喂不添加任何抗菌藥物的全價飼料，自由采食飲水。試驗前后各組飼養(yǎng)條件相同。

1.3.2 給藥與樣品采集 常規(guī)劑量組以250 mg/L，加大劑量組333 mg/L集中飲水給藥5 d，空白對照組不給藥。停藥后4 h、3 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d分別隨機宰殺24只，采集肌肉、肝臟和雞胗，于-20 ℃保存。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTM BEH C18(1.7 μm，2.1×50 mm)；柱溫30 ℃；流動相A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液；進樣量5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序Tab 1 Procedure of gradient elution

1為即時變化，6為線性變化

1.3.4 質譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監(jiān)測MRM；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣容量800 L/h；錐孔電壓25 V；錐孔氣流速150 L/h；毛細管電壓3.3 kV；定性、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子及對應的錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair,the corresponding cone volt and collision enerey

1.3.5 標準曲線 精密吸取100 μg/L的土霉素標準中間液0.02、0.05、0.08、0.10、0.20 mL，分別加空白基質0.98、0.95、0.92、0.90、0.80 mL，混勻，制成2、5、8、10、20 μg/L的系列基質標準溶液，依次上機，以土霉素的質量濃度為橫坐標，定量離子的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.6 樣品前處理 稱取(2±0.02)g肌肉、肝臟、雞胗已勻漿樣品，置50 mL離心管中，加入15 mL緩沖液，漩渦振蕩20 min，14000 r/min低溫離心5 min，取上清液進行樣品凈化。HLB固相萃取小柱用3mL甲醇、3mL水活化。然后分別取上述肌肉、肝臟、雞胗待凈化的上清液注入該萃取小柱中，分別依次用超純水3 mL、5%甲醇水溶液3 mL淋洗，棄去淋洗液，再用3 mL甲醇洗脫，洗脫液60 ℃水浴中氮氣儀吹干，殘渣用1 mL 30%甲醇溶液復溶，充分混勻，殘渣溶液過0.22 μm針頭式過濾器后，濾液供液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測。

1.3.7 檢測限和定量限 取空白雞肉、雞肝和雞胗試樣組織，添加適量的土霉素標準溶液，經(jīng)處理上機。

1.3.8 靈敏度和準確度 分別取空白雞肉、雞肝、雞胗組織，添加5、10、20 μg/kg的土霉素標準物進行回收率實驗，每個濃度做5個平行樣品。

2 結果與分析

2.1 線性關系 土霉素在2～20 μg/L濃度范圍內

呈現(xiàn)良好的線性關系，其曲線方程為:y=3256x+379.6，相關系數(shù)R為0.9995。標準溶液圖譜如圖1。

圖1 10 μg/mL基質工作液的特征色譜圖Fig 1 Chromatchromatogram of 10 μg/mL standard solution

2.2 檢測限和定量限 根據(jù)特征質量色譜峰的信噪比S/N>3為檢測限，S/N>10為定量下限，得肌肉、肝臟和雞胗組織中土霉素的檢測限為5 μg/kg，定量下限為10 μg/kg。

2.3 靈敏度和準確度 土霉素在5、10、20 μg/kg 3個添加水平上，其平均回收率、相對標準偏差見表3。土霉素的回收率在79.1%～93.6%之間，相對標準偏差均小于10%。圖2為空白雞肉的土霉素特征離子質量色譜圖，圖3為空白雞肉中添加25 μg/kg的土霉素特征離子質量色譜圖。

表3 土霉素回收率及相對標準偏差試驗Tab 3 Test of recovery rate and relative standard deviation of Oxytetracycline

圖2 空白雞肉的土霉素特征離子質量色譜圖Fig 2 The characteristic ion quality chromatogram of oxytetracycline in blank chicken

圖3 空白雞肉中添加25 μg/kg土霉素的特征色譜圖Fig 3 Chromatogram of oxytetracycline(25 μg/kg) in blank chicken

2.4 肉雞組織中土霉素殘留消除 空白對照組飼養(yǎng)情況和采樣時間點與試驗組一致，在組織中均未檢出土霉素殘留，表明試驗動物在試驗期間未受到其他來源藥物的影響。表4、表5結果顯示，肉雞分別按250 mg/L和333 mg/L劑量集中飲水給藥50%鹽酸土霉素可溶性粉，連續(xù)5 d。土霉素在停藥0 d的雞胗部位濃度最高，其次為肝臟，肌肉組織中藥物濃度最低。在停藥后第5天，兩組別的肌肉和肝臟中的藥物殘留量已低于MRL，分別為44.81 μg/kg和157.56 μg/kg。對于雞胗，我國尚未規(guī)定其最高殘留限量。試驗結果表明，停藥4 h時，雞胗中藥物殘留濃度最高，但其消除速度很快；停藥5d時，已接近肌肉中的藥物殘留量，其消除規(guī)律與肌肉和肝臟相似。經(jīng)統(tǒng)計分析，兩種給藥劑量組在肌肉、肝臟和雞胗中土霉素殘留量的差異不顯著(P>0.05)。

2.5 休藥期 采用WTl.4軟件計算休藥期，確保有95%的可信限使99%的殘留低于MRL，兩試驗組在肉雞不同組織中的休藥期見表6。

表4 250 mg/L劑量組肉雞組織中土霉素殘留量平均值Tab 4 The average residues of 250 mg/L oxytetracycline in broiler tissues

表5 333 mg/L劑量組肉雞組織中土霉素殘留量平均值Tab 5 The average residues of 333 mg/L oxytetracycline in broiler tissues

表6 土霉素在肉雞組織中的休藥期Tab 6 The withdrawal of oxytetracycline in broiler tissues

結果顯示，250 mg/L給藥濃度在肉雞組織中的休藥期分別為肌肉4.65 d，肝臟6.17 d，333 mg/L給藥濃度的休藥期分別為5.71 d，7.85 d，其中肝臟休藥時間最長。為了確保消費者健康安全，在實際養(yǎng)殖環(huán)境中，50%鹽酸土霉素可溶性粉按250 mg/L和333 mg/L給藥濃度，建議在肉雞的休藥期分別為7、8 d。

3 討論與小結

在獸藥組織殘留消除規(guī)律研究中，藥物的劑型、生產(chǎn)工藝、動物本身的差異對組織中藥物殘留濃度都有影響。表4、表5結果表明，兩個劑量組肌肉、肝臟中土霉素殘留量在停藥后5 d均低于國家規(guī)定的MRL，本試驗結果與劉世磊等報道[9]相似。雞胗作為消化器官，在停藥4 h，藥物殘留量最大，且藥物在該部位消除迅速，停藥5 d藥物殘留量低于肝臟，這是因為肝臟是土霉素的主要代謝器官。

表6結果表明，經(jīng)WTl.4軟件計算，250 mg/L劑量組肌肉的休藥期符合說明書中休藥期5 d的規(guī)定，但是，250 mg/L劑量組肝臟和333 mg/L劑量組肌肉和肝臟的休藥期結果與說明書規(guī)定不一致，雖然停藥后5 d，兩組動物的肌肉和肝臟中的藥物殘留都已低于MRL，但本試驗數(shù)據(jù)采用WT1.4軟件處理，在統(tǒng)計學上考慮了各種藥物由于劑型或處方的不同以及動物本身的差異，使計算得到的休藥期數(shù)據(jù)與國家規(guī)定的不一致。而其他文獻報道是根據(jù)殘留濃度低于MRL的停藥時間點來確定休藥期[1]。因此，為確保動物性食品更高的安全性，在上述兩種方法飲水給藥50%鹽酸土霉素可溶性粉后，根據(jù)使用劑量建議休藥期分別為7、8 d。對于本研究中與說明書規(guī)定休藥期不一致的情況，可能是休藥期計算方式或動物之間差異造成?，F(xiàn)今消費者對于雞胗的食用量加大，但是我國對雞胗這個可食性組織的殘留限量未做出規(guī)定，因此本試驗的研究為制定雞胗組織合理休藥期提供了一定的科學依據(jù)。

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