崔 怡，劉 莎，黃 杰，李金貴*

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

球蟲病是家禽養(yǎng)殖業(yè)中一種常見且嚴(yán)重的寄生蟲病，通常由一種或多種球蟲共同感染引起，其中致病性最強的是柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella，E.tenella)。該病的發(fā)病率為50%～70%，死亡率可達(dá)50%，常導(dǎo)致生產(chǎn)性能嚴(yán)重下降而給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失[1-2]。對于該病的防治仍以化學(xué)藥物為主，但隨著藥物的長期使用，抗藥性已經(jīng)非常普遍，且出現(xiàn)抗藥性的周期越來越短，給開發(fā)新藥帶來很大壓力，由此可見單純的化學(xué)藥物防治難以滿足市場需求[3-4]。研究表明丁酸可在腸道中產(chǎn)生短鏈脂肪酸為腸道上皮細(xì)胞提供直接能量來源，還能促進(jìn)損傷修復(fù)，有利于建立并維持腸道非特異性免疫屏障[5]。丁酸鈉具有調(diào)節(jié)腸道pH，提高腸道消化酶活性，促進(jìn)消化吸收的作用[6]，還具有廣泛的抗炎作用[7]。近年來有研究表明在日糧中添加丁酸類衍生物可以促進(jìn)腸粘膜、腸絨毛生長與損傷修復(fù)，進(jìn)而減輕雞球蟲的致病程度[8-9]，多項研究表明[10-12]包膜丁酸鈉(Coated sodium butyrate，CSB)對禽類腸道、免疫及生產(chǎn)性能都有維持和保護(hù)作用。 潘麗俊等[13]報道稱日糧中添加包膜丁酸鈉能夠提高家兔抵抗球蟲感染的能力。癸氧喹酯(decoquinate，DQ)是目前防治球蟲病的主要有效藥物之一，主要作用于球蟲生活史的早期階段，干擾DNA 合成而阻止蟲體發(fā)育。國內(nèi)有關(guān)學(xué)者的相繼研究表明DQ具有明顯的抗球蟲效果[14-16]，但對某些地方球蟲蟲株需要較高的劑量(500 mg/kg)才能達(dá)到理想的效果[17]。

為了減少化學(xué)藥物的使用量并減緩抗藥性的出現(xiàn)，在使用抗球蟲藥的同時，添加一些腸道保護(hù)劑、促生長劑等增強抗球蟲藥的療效，研究選用CSB與DQ聯(lián)合用藥，通過球蟲病臨床癥狀、糞便卵囊排出情況、盲腸病變記分以及組織病理學(xué)觀察來驗證聯(lián)合用藥對E.tenella的防治作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗動物 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供的雛雞飼料，不含抗球蟲藥和抗生素。包膜丁酸鈉(CSB)由杭州康德權(quán)飼料有限公司生產(chǎn)提供，丁酸鈉含量30%。癸氧喹酯(DQ)由山東德州神牛藥業(yè)有限公司提供，批號：20160807，含量為99.8%。100只1日齡雄性綠殼蛋雞，購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，飼養(yǎng)于揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院實驗動物房，飼養(yǎng)環(huán)境經(jīng)甲醛、高錳酸鉀熏蒸，氨水噴灑消毒，飼養(yǎng)時統(tǒng)一光照，自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)至13日齡開始試驗。E.tenella孢子化卵囊，為揚州大學(xué)中獸醫(yī)教研室采集病料分離，并經(jīng)雛雞接種純化后獲得的孢子化卵囊。

1.2 試驗方法 將試驗雞平衡體重后分為五組，每組20只，分兩個重復(fù)(n=10)。空白對照組(Control)、感染對照組(E.tenellainfection，EI)、感染+包膜丁酸鈉組(EI+CSB)、感染+癸氧喹酯組(EI+QD)、感染+包膜丁酸鈉+癸氧喹酯組(EI+CSB+DQ)。14日齡時，除對照組外EI組每只經(jīng)口接種8萬個孢子化卵囊。接種球蟲前1d開始用藥直至實驗結(jié)束，所有藥物均勻拌料后自由采食，自由飲水，Control組與EI組的飼料無藥物添加，其他條件保持一致。觀察感染后臨床表現(xiàn)，包括精神、飲食以及糞便情況等。接種球蟲后，注意觀察雞群發(fā)病情況，在出現(xiàn)血便時開始糞便卵囊計數(shù)，計算每克糞便中卵囊數(shù)(oocysts per gram, OPG)，同時進(jìn)行血便計分。對病死雞進(jìn)行剖檢，觀察盲腸與其他器官的病變情況。接種球蟲第7d稱重后處死試驗雞，統(tǒng)計盲腸病變記分。

1.3 血便記數(shù)、盲腸病變記分和抗球蟲指數(shù) 血便數(shù)量計數(shù)；試驗結(jié)束時解剖檢查盲腸病變情況，盲腸病變記分按Johnson和Reid制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病變記分的評定[18]。按美國默克公司方法計算相對增重率、存活率、病變值(病變計分×10)和卵囊值，據(jù)此計算抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index, ACI)，ACI=(相對增重率+存活率)-(病變值+卵囊值)。

1.4 病理組織觀察 采集盲腸組織樣本，10%中性甲醛溶液固定，制備常規(guī)HE染色切片4 μm，鏡檢盲腸組織病變情況。

1.5 統(tǒng)計分析 所有試驗數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 19.0版統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單向方差分析(One-way ANOVA),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，差異顯著性判斷以P<0.05作為差異顯著，P<0.01作為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 各組試驗雞的臨床癥狀 試驗期間，對照組精神狀態(tài)良好，飲食正常，無球蟲感染。接種卵囊72 h后，各感染組均出現(xiàn)不同程度的下痢，病雞精神狀態(tài)尚可。至96 h左右觀察到EI組和CSB組病雞精神沉郁，然后出現(xiàn)鮮紅血便，DQ處理的兩組未見血便。120 h時EI組和CSB組的血便明顯增多，其他感染組并未發(fā)現(xiàn)血便，飲食正常。到144 h時發(fā)現(xiàn)EI組和CSB組血便有明顯減少，CSB+DQ組和DQ組僅出現(xiàn)零星血便。繼續(xù)觀察到168 h時EI組和CSB組血便數(shù)量持續(xù)減少，但精神狀態(tài)并未改善；CSB+DQ組和DQ組僅存在微量血便，精神狀態(tài)較好，食欲正常。

試驗結(jié)束時統(tǒng)計增重情況發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，EI組和CSB組的增重均顯著下降，而DQ組和CSB+DQ組均逆轉(zhuǎn)了球蟲感染引起的增重下降(表2)。

2.2 各組的卵囊排出情況以及抗球蟲指數(shù)比較 攻毒后120 h開始觀察糞便中卵囊，136h觀察到EI組和CSB組出現(xiàn)卵囊，卵囊數(shù)持續(xù)增高直到144 h EI組排出卵囊數(shù)達(dá)到高峰，此時EI組糞便卵囊數(shù)均明顯高于CSB組。 160 h后EI 組卵囊數(shù)開始下降，CSB組達(dá)到高峰，兩組卵囊數(shù)無顯著性差異。168 h EI組和CSB組卵囊數(shù)均大幅度減少。DQ組僅在168 h觀察到少量卵囊，CSB+DQ組和對照組在試驗期間未觀察到卵囊。EI和CSB組ACI不足120，CSB+DQ組和DQ組的ACI均在180以上(表3～表4)。從臨床癥狀、卵囊排出情況、增重以及ACI等綜合看來，聯(lián)合用藥組效果最好。

表2 各組試驗雞的體重變化(n=20)Tab 2 The change of body weight in different groups(n=20)

同列數(shù)據(jù)相比，肩標(biāo)字母相同的差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)字母不相同的差異顯著(P<0.0.5)。相對增重率(relative body weight gain, RBWG%)

In the same column, values with same superscripts (a, b and c) mean no significant difference among groups (P>0.05); values with different superscripts (a, b and c) mean significant difference (P<0.05). relative body weight gain: RBWG%

表3 每克糞便卵囊值(×105)Tab 3 Oocysts per gram feces(×105)

同表2。

Same as Tab2.

表4 各試驗組抗球蟲指數(shù)Tab 4 Anti-coccidial effect of different treatment groups

ACI ≥180判定為敏感，160≤ACI<18為良好，120 ≤ACI<160為差，ACI<120為無效。字母肩標(biāo)相同為差異不顯著，字母肩標(biāo)不相同為差異顯著(P<0.05)。相對增重率(relative body weight gain, RBWG%)；存活率(survive rate, RSR%)；卵囊值(oocysts index, OI)；盲腸病變記分(cecum lesion scores, LS)；抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index, ACI)

ACI≥180 means high effective, 160≤ACI <18 means middle effective, 120≤ACI <160 means lower effective, ACI <120 means invalid, values with same superscripts (a, b and c) mean no significant difference among groups (P>0.05), values with different superscripts (a, b and c) mean significant difference(P<0.05). relative body weight gain: RBWG%, survive rate: RSR%, oocysts index: OI, cecum lesion scores: LS, anticoccidial index: ACI.

2.3 各組雞盲腸組織病理學(xué)觀察 從病理切片可以看出EI組腸絨毛結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，可見大量卵囊和配子體；CSB組同樣可見大量卵囊、配子體寄生于盲腸，但腸絨毛結(jié)構(gòu)相對完整；CSB+DQ組腸絨毛、腸腺結(jié)構(gòu)完整，邊緣大量杯狀細(xì)胞，并未見蟲體；DQ組盲腸結(jié)構(gòu)完整沒有蟲體寄生，但腸絨毛邊緣杯狀細(xì)胞較少(圖1)。

a: control組；b, b’: EI組；c: CSB組；d: DQ組；e: CSB+DQ組黑色箭頭：配子體；白色箭頭：卵囊；空心箭頭：脫落的腸絨毛a: control group；b, b’: EI group；c: CSB group；d: DQ group；e: CSB+DQ group;Black arrow：gamelocyte；White arrow：Oocysts；Hollow arrow：intestinal villi fell away圖1 雞盲腸組織病理學(xué)觀察(HE：400×) Fig 1 Histopathological analysis of cecal of chickens.(HE: 400×)

3 討論與小結(jié)

研究表明包膜丁酸鈉(CSB)具有修復(fù)腸絨毛，為腸道提供營養(yǎng)，抑制有害菌群的生長和爆發(fā)，調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)，抑制炎癥，增加飼料利用率的作用，甚至被當(dāng)作一種潛在的抗生素的替代品[19-21]，CSB對艾美耳球蟲感染的腸道菌群失衡有改善作用，試驗發(fā)現(xiàn)CSB對健康雞的腸道菌群沒有明顯的抑制作用，但可以顯著減少球蟲感染引起的硬壁桿菌數(shù)目和擬桿菌門的豐度[22]。還有研究表明CSB和抗球蟲藥配合使用可提高抗球蟲療效，特別是對妥曲珠利、地克珠利和尼卡巴嗪等不敏感的球蟲蟲株[23]。

試驗只有CSB組和EI組臨床癥狀嚴(yán)重，與EI組相比CSB組在144 h后血便情況大幅度改善。從糞便卵囊計數(shù)發(fā)現(xiàn)，EI組卵囊數(shù)在144 h達(dá)到高峰，CSB組到160 h才達(dá)到高峰，且EI組在高峰時的卵囊數(shù)高于CSB組，在168 h時卵囊數(shù)降到相同水平；DQ組僅在168 h發(fā)現(xiàn)少量卵囊排出，CSB+DQ組并未發(fā)現(xiàn)卵囊排出。結(jié)合組織病理學(xué)切片觀察，可以看到EI組和CSB組均存在大量蟲體，但CSB組腸絨毛結(jié)構(gòu)相對完整。DQ組和CSB+DQ組未發(fā)現(xiàn)蟲體，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，不過CSB+DQ組杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯高于DQ組和對照組。杯狀細(xì)胞的分泌產(chǎn)物在腸道固有免疫方面起著重要的作用，杯狀細(xì)胞分泌的MUC、ITF和RELMβ均可維持腸粘膜穩(wěn)態(tài)，緩解寄生蟲感染引起的炎癥，腸道感染疾病均伴隨著杯狀細(xì)胞的增多[24]。以上結(jié)果提示CSB在提高腸道的防御能力、保護(hù)腸絨毛的完整性、減緩和縮短球蟲病病程方面存在一定的效果，但是效果有限。

在試驗中CSB與DQ聯(lián)合用藥組的增重情況、卵囊排出情況均比單獨應(yīng)用DQ效果好，故聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生了一定的增效作用，但不是特別顯著，這可能是試驗所用的E.tenella蟲株對DQ比較敏感，DQ單獨用藥的ACI已經(jīng)達(dá)到180，故沒有體現(xiàn)出特別明顯的增效作用。還有可能是因為CSB提前添加的時間比較短，球蟲接種時還未起到對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，若提前一周預(yù)防給藥或許能提高CSB的作用效果，這有待于進(jìn)一步研究。

本試驗結(jié)果表明，CSB單獨用藥能推遲血便并減少卵囊排出，但未能達(dá)到防治球蟲的作用。CSB與DQ聯(lián)合用藥時能增強DQ的抗球蟲效果，這說明CSB能適度增強腸道屏障功能，與DQ合用具有一定的增效作用。

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