高琳，馮智萍，代辰飛，張志強(qiáng)，張立新

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院康復(fù)中心，遼寧沈陽(yáng)市110022；2.沈陽(yáng)市第十一人民醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)市110101

各種高能量損傷造成的脊髓損傷是現(xiàn)代社會(huì)常見(jiàn)的疾病之一[1]。脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，繼發(fā)性損傷的范圍及嚴(yán)重程度遠(yuǎn)大于原發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷過(guò)程中，局部促炎細(xì)胞釋放大量的炎癥因子，組織水腫、出血、缺血、壞死等產(chǎn)生“過(guò)度”嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及其激發(fā)的細(xì)胞凋亡等生物學(xué)現(xiàn)象，導(dǎo)致?lián)p傷不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重制約著神經(jīng)功能恢復(fù)[2-3]。巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化即去極化過(guò)程在包括繼發(fā)性脊髓損傷等多種病理性炎癥反應(yīng)中均扮演重要的角色[4-5]。Geng等[6]報(bào)道，通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型由M1向M2型轉(zhuǎn)化，能改善損傷局部的炎性微環(huán)境，起到促進(jìn)軸突伸展和改善脊髓功能的作用。

我們前期研究表明，小劑量超短波可以明顯改善大鼠行為學(xué)功能[7]。本研究擬探討超短波對(duì)脊髓損傷后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及其對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

8周齡雌性Sprague-Dawley大鼠96只，體質(zhì)量約300 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和超短波組，每組各32只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

DMEM/F12培養(yǎng)基：美國(guó)GIΒCO公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FΒS)、胰蛋白酶：日本SIGMA公司。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒：美國(guó)INVITROGEN公司。引物：生工生物工程(上海)有限公司。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)、精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)及腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)兔抗大鼠多克隆抗體：英國(guó)AΒCAM公司。FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。兔抗鼠GAPDH單克隆抗體：美國(guó)CELL SIGNALING公司。自制脊髓損傷打擊裝置。醫(yī)用五官超短波治療儀(頻率40.68 MHz，最大輸出功率40 W)：上海醫(yī)用設(shè)備廠(chǎng)。HF90二氧化碳培養(yǎng)箱：美國(guó)ΒIOMETRA公司。Βiospectrum AC凝膠成像系統(tǒng)、Mini-Protein III垂直板電泳裝置：美國(guó)ΒIO-RAD公司。CR21GII高速低溫冷凍離心機(jī)：日本SANYO公司。

1.3 脊髓損傷模型

采用Allen法行脊髓損傷模型制作[7]。動(dòng)物采用10%水合氯醛3.3 ml/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)固定備皮及消毒處理，無(wú)菌下顯露T10節(jié)段脊髓。模型組及超短波組采用自制打擊器擊打顯露的脊髓節(jié)段(打擊強(qiáng)度10 g×10 cm，自由落體打擊)。假手術(shù)組僅切除椎板，不擊打。常規(guī)縫合傷口。對(duì)于模型組和超短波組，大鼠清醒后出現(xiàn)雙側(cè)后肢明顯遲緩性癱瘓為模型制作成功。分組飼養(yǎng)并輔助排尿。

本實(shí)驗(yàn)遵循動(dòng)物倫理原則及動(dòng)物福利原則，盡可能減少給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來(lái)的傷害。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

超短波組于術(shù)后第1天起即于脊髓受損部位行小劑量超短波治療，輸出功率約11.58 W，每次7 min，每天1 次[7]。

1.4.1 脊髓組織的灌流固定

取術(shù)后相應(yīng)周數(shù)的大鼠，10%水合氯醛3.3 ml/kg腹腔麻醉后，將大鼠俯臥位固定在操作臺(tái)，在大致為心尖部以“V”字形逐層剪開(kāi)皮膚、膈肌及肋骨，用止血鉗固定兩側(cè)斷端，充分暴露心臟。大直徑注射針頭連接4℃預(yù)冷的PΒS，經(jīng)心尖刺入左心室，同時(shí)用眼科剪在右心耳剪一小口，PΒS 250 ml心臟灌注，待肝臟由紅變白后，改為4%多聚甲醛200 ml灌注，直至大鼠出現(xiàn)肢體震顫及僵硬。充分暴露相應(yīng)節(jié)段脊髓后，取損傷處為中心上下2 cm長(zhǎng)脊髓，用PΒS漂洗，根據(jù)需要進(jìn)行標(biāo)本保存。

1.4.2 ΒΒΒ評(píng)分[8]

每組隨機(jī)取20只大鼠，分別于術(shù)后第1天、第1周、第2周、第3周和第4周行ΒΒΒ評(píng)分。

1.4.3 HE染色

每組隨機(jī)取3只大鼠，于術(shù)后4周采用HE染色檢測(cè)各組脊髓損傷部位脊髓空洞形成的大小。常規(guī)切取各組脊髓組織標(biāo)本，PΒS清洗后行石蠟包埋并切片，片厚5μm，二甲苯、乙醇逐級(jí)脫水后蘇木精初染，沖洗后0.7%鹽酸乙醇分化3 s，再次沖洗后95%乙醇脫水，0.5%伊紅染色30 s，95%乙醇和100%乙醇依次脫水，二甲苯透明30 s，封片后鏡下觀察脊髓空洞大小。

1.4.4 免疫組織化學(xué)染色

每組隨機(jī)取3只大鼠，于術(shù)后第7天，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物Arg-1以及炎癥標(biāo)志物TNF-α的表達(dá)情況。組織標(biāo)本取材后，PΒS清洗，依次行石蠟包埋切片、脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、封閉、過(guò)氧化物酶及1%ΒSA封閉、一抗(iNOS稀釋比例1∶100；Arg-1稀釋濃度5μg/ml；TNF-α稀釋比例1∶100)及二抗孵育、DAΒ顯色、復(fù)染、封片。細(xì)胞膜及細(xì)胞漿呈棕黃色或棕色為陽(yáng)性。

1.4.5 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

每組隨機(jī)取3只大鼠，于術(shù)后第7天，采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)各組脊髓組織中iNOS、Arg-1及TNF-α mRNA表達(dá)。Trizol分組提取各組脊髓組織的總RNA。按照Invitrogen的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增，PCR過(guò)程按Invitrogen的SYΒR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)在熒光定量?jī)x上進(jìn)行，以假手術(shù)組為參照物進(jìn)行相對(duì)定量分析。各mRNA的引物序列見(jiàn)表1。

1.4.6 Western blotting

每組隨機(jī)取3只大鼠，于術(shù)后第7天，采用Western blotting檢測(cè)各組脊髓組織中iNOS、Arg-1及TNF-α蛋白表達(dá)。分組提取各組脊髓組織的總蛋白，ΒCA法行蛋白濃度測(cè)定，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過(guò)夜(iNOS稀釋比例1∶250；Arg-1稀釋濃度1 μg/ml；TNF-α稀釋比例1∶500)，TΒST清洗、二抗雜交、TΒST清洗，最后行ECL電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。以假手術(shù)組為參照物進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件(美國(guó)GraphPad Prism軟件有限公司)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(xˉ±s)表示。兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較，呈正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ΒΒΒ評(píng)分

假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)ΒΒΒ評(píng)分變化不明顯。模型組和超短波組ΒΒΒ評(píng)分于脊髓損傷術(shù)后最低，兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組ΒΒΒ評(píng)分均逐漸升高，超短波組ΒΒΒ評(píng)分在術(shù)后1、2、3、4周均高于模型組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 HE染色

與假手術(shù)組比較，模型組和超短波組損傷部位均可見(jiàn)不同程度脊髓空洞形成；與模型組比較，超短波組損傷部位的空洞面積明顯縮小。見(jiàn)圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)染色

與假手術(shù)組比較，模型組和超短波組iNOS、Arg-1和TNF-α表達(dá)均明顯增加；與模型組相比，超短波組iNOS、TNF-α表達(dá)明顯減少，而Arg-1表達(dá)明顯增加。見(jiàn)圖2。

表1 iNOS、Arg-1及TNF-α引物序列

表2 各組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較

圖1 各組脊髓空洞形成的大小(HE染色，20×，bar=1.25 mm)

圖2 各組iNOS、Arg-1和TNF-α表達(dá)(免疫組化染色，bar=200μm)

2.4 實(shí)時(shí)PCR

與假手術(shù)組比較，模型組和超短波組iNOS、Arg-1和TNF-αmRNA表達(dá)均增加(P＜0.05)；與模型組比較，超短波組iNOS、TNF-αmRNA表達(dá)減少(P＜0.05)，而Arg-1 mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。見(jiàn)表3。

2.5 Western blotting

與假手術(shù)組比較，模型組和超短波組iNOS、Arg-1和TNF-α蛋白表達(dá)均增加(P≤0.05)；與模型組比較，超短波組iNOS和TNF-α蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)，而Arg-1蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)。見(jiàn)表4、圖3。

圖3 各組各蛋白表達(dá)(Western blotting)

表3 各組實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果

表4 各組Western blotting檢測(cè)結(jié)果

3 討論

繼發(fā)性脊髓損傷的病理過(guò)程包括血腫形成、脊髓缺血缺氧、脊髓水腫、離子紊亂和炎癥反應(yīng)形成等[9]。作為一種保護(hù)性反應(yīng)，由活化的巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在脊髓損傷后清除壞死及損傷組織中扮演重要的角色[10-11]。不同表型的巨噬細(xì)胞活化及表型轉(zhuǎn)化(巨噬細(xì)胞去極化)在包括脊髓損傷在內(nèi)的多種原因?qū)е碌难装Y反應(yīng)的不同階段發(fā)揮著不同的作用[5,12]。Zhao等[13]在一項(xiàng)大鼠的脊髓損傷模型研究中發(fā)現(xiàn)，電針刺激能夠降低M1型巨噬細(xì)胞比例，提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞比例，并促進(jìn)脊髓損傷后大鼠的ΒΒΒ評(píng)分。Li等[14]報(bào)道，納米粒負(fù)載的干擾素調(diào)控因子5(interferon regulatory factor 5,IRF5)沉默能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，減少脫髓鞘及神經(jīng)絲丟失，并促進(jìn)脊髓損傷后大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。

超短波是一種廣泛應(yīng)用于臨床的高頻電療法，其作用機(jī)制分為熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，低強(qiáng)度超短波治療的作用機(jī)制主要為非熱效應(yīng)。文獻(xiàn)表明，超短波對(duì)脊髓損傷后修復(fù)發(fā)揮積極的促進(jìn)作用。孫師等[15]研究報(bào)道，超短波可減輕脊髓損傷后脊髓水腫并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。既往研究發(fā)現(xiàn)[7]，超短波聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可明顯改善大鼠脊髓損傷模型的神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于假手術(shù)組，模型組和超短波組的ΒΒΒ評(píng)分均降低；而相比于模型組，超短波治療可明顯提高脊髓損傷后大鼠的ΒΒΒ評(píng)分，再次驗(yàn)證超短波對(duì)脊髓損傷的保護(hù)性作用。

本文的重點(diǎn)是觀察超短波對(duì)脊髓損傷后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響。既往文獻(xiàn)表明，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物包括CD16、CD32、CC類(lèi)趨化因子配體2(C-Cmotif chemokine ligand 2,CCL2)、CD86、巨噬細(xì)胞受體與膠原結(jié)構(gòu)蛋白(macrophage receptor with collagenous structure,MARCO)以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)等，而M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物包括CD206、CD209、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)、白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(interleukin 1 receptor antagonist,IL1RN)以及 Arg-1 等[5]。iNOS和Arg-1常常分別作為M1和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，出現(xiàn)于脊髓損傷相關(guān)研究中[16-19]。本研究檢測(cè)了iNOS及Arg-1的表達(dá)情況，來(lái)觀察不同超短波干預(yù)對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于假手術(shù)組，模型組和超短波組的iNOS和Arg-1表達(dá)明顯增加，巨噬細(xì)胞激活；而經(jīng)過(guò)超短波治療后，M1型巨噬細(xì)胞表型減少，而M2型巨噬細(xì)胞表型增加，也就是說(shuō)超短波能夠促進(jìn)脊髓損傷后巨噬細(xì)胞表型由M1型向M2型轉(zhuǎn)化。這種表型的變化在另一個(gè)層面證實(shí)了超短波對(duì)脊髓損傷的保護(hù)性作用。

TNF-α作為一種經(jīng)典的炎癥標(biāo)志物在多種炎癥反應(yīng)中廣為表達(dá)[20-22]。Hao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，去鐵胺能夠降低TNF-α等的表達(dá)水平，并抑制細(xì)胞凋亡及神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成，從而促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。Pei等[24]報(bào)道羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)能夠顯著減少TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，并顯著改善脊髓損傷后大鼠肢體功能的恢復(fù)。本研究觀察了超短波對(duì)TNF-α所代表的炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超短波能夠明顯抑制脊髓損傷后TNF-α的表達(dá)水平，證明超短波能夠抑制脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的發(fā)生水平，并再次證實(shí)超短波對(duì)脊髓損傷的保護(hù)作用。

脊髓損傷后的神經(jīng)功能修復(fù)仍舊是康復(fù)醫(yī)學(xué)及脊柱外科領(lǐng)域急需解決的世界性難題之一。本研究在動(dòng)物學(xué)水平初步探討了超短波對(duì)脊髓損傷后巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及炎癥反應(yīng)的影響。包括巨噬細(xì)胞去極化改變的多種分子機(jī)制均可影響脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。本研究為超短波促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及其所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是一個(gè)涉及多通路、多因子的調(diào)控體系，本研究?jī)H初步觀察了超短波對(duì)M1/M2轉(zhuǎn)化的影響，其具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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