程斌，楊峰，李鋒濤，林磊，薛建利，吳昊，葉勁濤

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西西安市710004；2.華縣人民醫(yī)院，陜西渭南市714100；3.漢中市中心醫(yī)院，陜西漢中市723000

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCII)指脊髓經(jīng)歷一段時(shí)間的缺血后，血液再灌注后，神經(jīng)功能不僅不能得到改善，反而出現(xiàn)神經(jīng)功能受損加重的現(xiàn)象[1-2]。多種原因可以導(dǎo)致SCII的發(fā)生，如脊柱創(chuàng)傷、血管外科手術(shù)等。脊髓組織屬于神經(jīng)組織，到目前為止，大多數(shù)研究仍認(rèn)為神經(jīng)組織缺血再灌注損傷是一種沒(méi)有有效治療方法的疾病。目前一般的處理方法為一旦發(fā)現(xiàn)SCII，立即予大劑量甲基強(qiáng)的松龍、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物等治療，可以促進(jìn)已受損的脊髓功能恢復(fù)，預(yù)防損傷進(jìn)一步加重[3]。

人參皂苷Rb1是人參皂苷最主要的活性成分之一[4]，具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、提高免疫力、減少細(xì)胞腫脹等作用。已有研究顯示，人參皂苷Rb1能明顯減輕腎、腦等臟器缺血再灌注損傷[5]，但在SCII方面報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察人參皂苷Rb1對(duì)于SCII后神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷的影響，為今后治療脊髓缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠134只，體質(zhì)量(213±15)g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 分組

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組。假手術(shù)組(n=12)同其他實(shí)驗(yàn)組一樣接受麻醉、介入操作，但不誘導(dǎo)脊髓缺血。SCII組(n=12)采用Fogarty導(dǎo)管阻斷胸主動(dòng)脈血流，同時(shí)通過(guò)放血法降低血壓，造成大鼠脊髓缺血，缺血10 min后撤去導(dǎo)管，開(kāi)始再灌注過(guò)程，再灌注48 h后處死大鼠。人參皂甙Rb1藥物組(藥物組，n=48)造模方法同SCII，脊髓缺血前30 min腹腔注射人參皂甙Rb1 10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，每個(gè)劑量組12只，術(shù)后每天腹腔注射相同劑量的人參皂甙Rb1。

1.2 主要儀器及試劑

丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所。動(dòng)物硬組織活性線粒體分離試劑盒、細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome Coxidase,COX)活性測(cè)定試劑盒：上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。多聚甲醛：天津化學(xué)試劑廠。人參皂甙Rb1粉劑：中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 模型建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食一夜。3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，保持自主呼吸。肛溫探頭置入肛門(mén)，動(dòng)物置于恒溫毯上，保持大鼠體溫維持37.1～37.5℃。取頸正中切口，顯露左側(cè)頸總動(dòng)脈，置入PE50導(dǎo)管并連接放血裝置及監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測(cè)近端動(dòng)脈壓及心率。在大鼠尾中段上1/3位置顯露尾動(dòng)脈，置入PE50導(dǎo)管并連接監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測(cè)遠(yuǎn)端動(dòng)脈壓。左側(cè)腹股溝切口，顯露左側(cè)股動(dòng)脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎后輕微牽拉，近端剪一切口，用注射器抽取生理鹽水0.05 ml，將Fogarty導(dǎo)管經(jīng)股動(dòng)脈置入到胸主動(dòng)脈高度。全部導(dǎo)管置入結(jié)束后，立即給予肝素鈉200 U。將注射器內(nèi)的生理鹽水0.05 ml推入，避免球囊松弛，同時(shí)立即打開(kāi)放血裝置放血，在1 min內(nèi)將近端平均動(dòng)脈壓緩慢降至45 mmHg，并記錄血壓及放血量。脊髓缺血10 min后，松開(kāi)球囊，立即勻速回輸放血裝置內(nèi)的血液，回輸時(shí)間亦控制在1 min左右。術(shù)后監(jiān)測(cè)血壓10 min后取出動(dòng)脈插管，結(jié)扎動(dòng)脈，皮下注射硫酸魚(yú)精蛋白4 mg。將動(dòng)物放置于25～30℃保溫箱內(nèi)，等待動(dòng)物蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中。

1.4 大鼠后肢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

分別在脊髓缺血再灌注或藥物干預(yù)48 h后，采用ΒΒΒ評(píng)分，對(duì)各組大鼠后肢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分人員為未參加本組實(shí)驗(yàn)而熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)人員。

1.5 標(biāo)本采集

動(dòng)物于脊髓缺血再灌注或藥物干預(yù)48 h后，心臟采血、處死。大鼠3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，心臟采血3 ml，室溫放置2 h后，1000 r/min離心10 min取血清，置于-20℃冰箱保存。之后升主動(dòng)脈插管，并剪開(kāi)右心房，快速灌注生理鹽水250 ml沖洗后，4%多聚甲醛繼續(xù)灌注至右心房流出清亮多聚甲醛、尸體僵硬。立即取出腰段脊髓組織1 cm作為標(biāo)本，將其放入4℃4%多聚甲醛中固定24 h，自來(lái)水浸洗24 h，石蠟包埋，于L3節(jié)段2 mm范圍內(nèi)連續(xù)切片，厚10μm。其余部分標(biāo)本用于血清SOD、MDA、COX的檢測(cè)。

1.6 血清及脊髓組織中SOD活性測(cè)定

采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，嚴(yán)格按照活性測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 血清及脊髓組織中MDA含量測(cè)定

采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，嚴(yán)格按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 脊髓組織中COX活性測(cè)定

1.8.1 脊髓組織線粒體的提取及其蛋白含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取脊髓組織的質(zhì)量，冰上操作，加入適量清洗液清洗后切碎，嚴(yán)格按照動(dòng)物硬組織活性線粒體分離試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

線粒體懸液采用考馬斯亮蘭法測(cè)定其線粒體蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定。

1.8.2 COX活性測(cè)定

嚴(yán)格按照COX活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料采用(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中意外死亡6只，其中SCII組4只，藥物組2只。分別在相同條件下予以補(bǔ)充。

2.1 ΒΒΒ評(píng)分

與假手術(shù)組比較，SCII組和藥物組ΒΒΒ評(píng)分均下降(P＜0.05)。藥物組 ΒΒΒ 評(píng)分均高于 SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，ΒΒΒ評(píng)分也相應(yīng)增高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見(jiàn)表1。

2.2 血清及脊髓組織中SOD活性

與假手術(shù)組比較，SCII組和藥物組血清及脊髓SOD活性下降(P＜0.05)。藥物組SOD活性均高于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，SOD活性也相應(yīng)增高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見(jiàn)表1。

2.3 血清及脊髓組織中MDA含量

與假手術(shù)組比較，SCII組和藥物組血清及脊髓MDA含量上升(P＜0.05)。藥物組MDA含量均低于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，MDA含量相應(yīng)降低，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見(jiàn)表1。

2.4 脊髓組織中COX活性

與假手術(shù)組比較，SCII組和藥物組脊髓COX活性下降(P＜0.05)。藥物組COX活性均高于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，COX活性也相應(yīng)升高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見(jiàn)表1。

3 討論

線粒體通過(guò)能量供給、細(xì)胞內(nèi)的鈣平衡、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成、促凋亡蛋白釋放的機(jī)制促進(jìn)凋亡，是細(xì)胞死亡的中樞性調(diào)節(jié)因子。主要的線粒體元件包括線粒體外膜及內(nèi)膜，呼吸鏈(復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ)以及復(fù)合體Ⅴ——COX。線粒體膜電位梯度在ATP合成及線粒體鈣平衡維持中起重要作用。細(xì)胞色素C松散結(jié)合在線粒體內(nèi)膜的外表面。超氧自由基是電子傳遞鏈中復(fù)合物Ⅰ的黃素復(fù)合體或者復(fù)合體Ⅲ的泛半醌的自氧化作用中氧化磷酸化的副產(chǎn)物[6]。

缺血再灌注損傷可以導(dǎo)致線粒體損害。整個(gè)過(guò)程可以被認(rèn)為是階段性的。早期階段由于缺乏作為電子最終接受體的氧，以及電子傳遞鏈的減少而導(dǎo)致呼吸功能改變，這些改變?cè)谥衅陔A段仍可逆[7]。中期階段線粒體功能進(jìn)一步改變，包括細(xì)胞色素C的釋放，以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的可逆性開(kāi)發(fā)。在該階段已開(kāi)始為不可逆的線粒體元件損害及細(xì)胞死亡提供了條件[8]。

表1 三組各指標(biāo)比較

氧化應(yīng)激在缺血再灌注損傷的作用已被確定。ROS在缺氧過(guò)程中可被看做是一種信號(hào)分子，也對(duì)細(xì)胞內(nèi)元件造成直接損害。線粒體源性ROS可以損害一個(gè)或多個(gè)呼吸鏈元件，并加速超氧化物的形成，線粒體是細(xì)胞損壞后ROS的主要來(lái)源[9]。微量滲析檢測(cè)顯示，大腦皮質(zhì)自由基產(chǎn)物在再灌注過(guò)程中升高[10]。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)的自由鈣濃度只有細(xì)胞外的1/1000。鈣離子通常通過(guò)電壓門(mén)控或受體門(mén)控鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞，然后與鈣結(jié)合蛋白結(jié)合，進(jìn)入鈣儲(chǔ)備細(xì)胞器，再被鈣泵和離子交換體清除。線粒體蓄積鈣的能力很強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣維持在生理穩(wěn)態(tài)時(shí)，它并不儲(chǔ)備過(guò)多的鈣；但是，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣超過(guò)0.5 μmol/L時(shí)(鈣超載)，線粒體會(huì)將多余的鈣儲(chǔ)存起來(lái)[11]。研究顯示，缺血再灌注損傷可以使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度從0.1μmol/L快速升至30～60μmol/L，甚至更高。在大鼠腦組織缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鈣離子進(jìn)入線粒體基質(zhì)，并通過(guò)阻斷線粒體的鈣離子傳遞系統(tǒng)介導(dǎo)線粒體損傷[12]。線粒體鈣負(fù)荷動(dòng)力學(xué)研究顯示[13]，在低氧低糖環(huán)境下，大鼠CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞在缺氧時(shí)和缺氧后，自由基產(chǎn)生與線粒體鈣蓄積有關(guān)。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔可以開(kāi)放，允許所有離子及一些小分子通過(guò)。該孔的開(kāi)放可以引起H+電位梯度崩潰以及ATP產(chǎn)物減少。該孔開(kāi)放的附加效應(yīng)是鈣離子釋放及氧化磷酸化的解偶聯(lián)，并引起ROS產(chǎn)物的爆發(fā)式產(chǎn)生。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的結(jié)構(gòu)改變可以使線粒體對(duì)存在于線粒體內(nèi)的許多促凋亡蛋白的通透性發(fā)生變化。已有實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到，在缺血再灌注損傷早期可見(jiàn)核轉(zhuǎn)錄因子及谷草轉(zhuǎn)氨酶的釋放。在腦組織缺血、局部缺血等條件下，亦可觀測(cè)到細(xì)胞色素C從線粒體到胞漿的再分布[14-15]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷中有氧化應(yīng)激機(jī)制參與[16-17]。實(shí)際上，脂質(zhì)過(guò)氧化物、過(guò)氧化氫等在損傷急性期已經(jīng)升高。氧化應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)氧化物與抗氧化物之間的平衡被打破形成的，對(duì)組織有損害作用，可能是造成神經(jīng)細(xì)胞損傷的原因之一。神經(jīng)組織富含不飽和脂肪酸，對(duì)自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用非常敏感，而此時(shí)抗氧化酶如過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等的含量很低[18]。同時(shí)，氧化應(yīng)激還可以損傷線粒體功能[19]。

SOD是廣泛分布于各種生物體內(nèi)的重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)[20]，是生物體抗氧化能力的首選觀測(cè)指標(biāo)。所以，諸多學(xué)者在缺血再灌注損傷試驗(yàn)中使用SOD活性作為氧化應(yīng)激損害程度的直觀指標(biāo)[21]。MDA可以由乙醛和甲酸乙酯縮合生成。在生物體內(nèi)，自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化作用終產(chǎn)物即為MDA，可以引起許多生物大分子的交聯(lián)，具有細(xì)胞毒性。MDA也是缺血再灌注損傷過(guò)程中氧化應(yīng)激損害的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于此類(lèi)實(shí)驗(yàn)[22]。SOD通過(guò)催化O2-歧化反應(yīng)，發(fā)揮抗氧自由基的作用，增強(qiáng)H2O2濃度的調(diào)節(jié)功能，保護(hù)組織細(xì)胞。MDA的測(cè)定常常與SOD的測(cè)定相互配合，兩者是反映脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度的重要指標(biāo)，結(jié)果分析有助于準(zhǔn)確掌握脊髓損傷程度。

COX由13個(gè)亞基組成，是呼吸鏈末端成員及其限速酶。其基因有線粒體編碼部分(3個(gè)亞基：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及細(xì)胞核編碼部分(10個(gè)亞基：Ⅳ、Ⅴa、Ⅴb、Ⅵa、Ⅵb、Ⅵc、Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc、Ⅷ)。核基因編碼的組織特異性亞基與不同組織的能量需求有關(guān)。ATP與ADP的比例可以調(diào)節(jié)COX的活性。ATP作為一種變構(gòu)抑制物，具有第二種呼吸調(diào)控機(jī)制，以對(duì)抗第一種呼吸調(diào)控機(jī)制。ATP抑制COX的變構(gòu)提示，可以通過(guò)信號(hào)傳遞途徑來(lái)對(duì)其亞基進(jìn)行可逆性的磷酸化，從而調(diào)節(jié)COX的活性[23]。COX可以通過(guò)其亞基的磷酸化來(lái)調(diào)控其活性，亞基Ⅰ第304位酪氨酸的磷酸化可以導(dǎo)致COX活性的明顯降低[24]。COX的Ⅴa亞基與3,5-二碘甲狀腺氨酸結(jié)合、內(nèi)源性NO或脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成，可以影響ATP對(duì)于COX的變構(gòu)抑制作用，但這種影響在應(yīng)激條件下很快被消除。

在缺氧條件下，線粒體編碼的COX亞基Ⅰ、Ⅱ及細(xì)胞核編碼的亞基Ⅳ、Ⅴb的mRNA出現(xiàn)相應(yīng)的表達(dá)下調(diào)，這被認(rèn)為與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的減少有關(guān)。另外，酶構(gòu)成及活性的變化伴隨著細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的變化。COX的Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ亞基在缺血再灌注損傷中特異性磷酸化可以導(dǎo)致COX的功能受損。研究顯示，在缺血再灌注損傷中，亞基Ⅰ、Ⅴ明顯下降，通過(guò)缺血預(yù)處理僅能部分緩解這種趨勢(shì)[25]。COX可以作為缺血再灌注過(guò)程中線粒體損傷的一個(gè)重要標(biāo)志。

人參皂苷Rb1是人參中達(dá)瑪烷型三萜皂苷類(lèi)化合物，具有多種生物活性，對(duì)人參皂苷Rb1代謝產(chǎn)物的分析已有報(bào)道，在大鼠尿液、糞便、胃和大腸中共檢出14種代謝產(chǎn)物[26]。通過(guò)靜脈注射藥物后，尿液中排出主要為原型藥物，也包含部分代謝產(chǎn)物。血液中藥物達(dá)峰時(shí)間約為1.02 h。通過(guò)口服給藥生物利用度低，進(jìn)入血液的原型藥物較少，在此基礎(chǔ)上發(fā)生的水解、結(jié)合、氧化和異構(gòu)化等代謝反應(yīng)也微乎其微?？诜o藥后尿液中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物多為進(jìn)入體內(nèi)的胃腸道菌群代謝產(chǎn)物，其中水解產(chǎn)物居多，形成多個(gè)脫糖的代謝產(chǎn)物，在尿液中，水解代謝產(chǎn)物的量高于原型藥物。本實(shí)驗(yàn)中選用腹腔注射藥物，一方面保證血藥濃度，另一方面保證足夠藥物在肝臟中進(jìn)行代謝反應(yīng)。有人使用1200 mg/kg口服藥物濃度進(jìn)行試驗(yàn)，得出結(jié)果血藥濃度1～20.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，之后上升趨勢(shì)減緩[27]?？紤]腹腔吸收藥物較口服生物利用率高，但仍有部分損失，所以實(shí)驗(yàn)組中20 mg/kg組未達(dá)最好效果。40 mg/kg組扣除固定損失部分后可能已達(dá)到血藥濃度上限，同理80 mg/kg組也達(dá)上限，所以40 mg/kg組與80 mg/kg組從各方面評(píng)價(jià)效果差距不大。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純的大鼠脊髓缺血再灌注損傷可以使脊髓組織的COX活性明顯降低，血清及脊髓組織的SOD活性明顯降低，MDA含量升高；說(shuō)明大鼠脊髓缺血再灌注損傷即會(huì)引起明顯的線粒體損傷及氧化應(yīng)激。藥物組各劑量組值雖都較假手術(shù)組降低，但與SCII組相比，COX活性和SOD含量升高，MDA含量下降，且這種改變隨藥物劑量增大而愈加明顯，但在干預(yù)劑量大于40 mg/kg后這種趨勢(shì)不再明顯。這證實(shí)人參皂甙Rb1干預(yù)可以促使大鼠COX活性提高，SOD活性提高，MDA生成減少，且這種變化趨勢(shì)在干預(yù)劑量小于40 mg/kg時(shí)呈劑量依賴(lài)。

[1]Crawford ES,Rubio PA.Reappraisal of adjuncts to avoid ischemia in the treatment of aneurysms of descending thoracic aorta[J].JThorac Cardiovasc Surg,1973,66(5):693-704.

[2]Wynn MM,Acher CW.A modern theory of spinal cord ischemia/injury in thoracoabdominal aortic surgery and its implications for prevention of paralysis[J].JCardiothorac Vasc Anesth,2014,28(4):1088-1099.

[3]夏炳江,肖魯偉.脊髓慢性壓迫減壓后缺血再灌注損傷研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2017,35(4):998-1001.

[4]王國(guó)麗,李曉嬌,張力娜,等.人參皂苷Rb1、Rg1對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用及相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志,2017,51(3):92-95.

[5]林少濱.人參皂苷Rb1后處理對(duì)大鼠全腦缺血再灌注后認(rèn)知功能的影響[J].海峽藥學(xué),2017,29(7):15-17.

[6]Murphy AN,Fiskum G,Βeal MF.Mitochondria in neurodegeneration:bioenergetic function in cell life and death[J].J CerebΒlood Flow Metab,1999,19(3):231-245.

[7]D'Herde K,De PrestΒ,Mussche S,et al.Ultrastructural localization of cytochrome C in apoptosis demonstrates mitochondrial heterogeneity[J].Cell Death Differ,2000,7(4):331-337.

[8]Cao XH,Zhao SS,Liu DY,et al.ROS-Ca(2+)is associated with mitochondria permeability transition pore involved in surfactin-induced MCF-7 cellsapoptosis[J].ChemΒiol Interact,2011,190(1):16-27.

[9]Wang Y,Jiang YF,Huang QF,et al.Neuroprotective effects of salvianolic acidΒagainst oxygen-glucose deprivation/reperfusion damage in primary rat cortical neurons[J].Chin Med J(Engl),2010,123(24):3612-3619.

[10]Ye R,Zhang X,Kong X,et al.Ginsenoside Rd attenuates mitochondrial dysfunction and sequential apoptosis after transient focal ischemia[J].Neuroscience,2011,178(3):169.

[11]Toescu EC,Gardner JM,Petersen OH.Mitochondrial Ca2+uptake at submicromolar[Ca2+]i in permeabilised pancreatic acinar cells[J].ΒiochemΒiophys Res Commun,1993,192(2):854-859.

[12]Schild L,Huppelsberg J,Kahlert S,et al.Βrain mitochondria are primed by moderate Ca2+rise upon hypoxia/reoxygenation for functional breakdown and morphological disintegration[J].JΒiol Chem,2003,278(28):25454-25460.

[13]Frantseva MV,Carlen PL,Perez Velazquez JL.Dynamicsof intracellular calcium and free radical production during ischemia in pyramidal neurons[J].Free RadicalΒiology & Medicine,2001,31(10):1216-1227.

[14]Zhao Q,Zhang C,Wang X,et al.(S)-ZJM-289,a nitric oxide-releasing derivative of 3-N-butylphthalide,protectsagainst ischemic neuronal injury by attenuating mitochondrial dysfunction and associated cell death[J].Neurochem Int,2012,60(2):134-144.

[15]Zhang H,Li Q,Li Z,et al.The protection ofΒcl-2 overexpression on rat cortical neuronal injury caused by analogous ischemia/reperfusion in vitro[J].Neurosci Res,2008,62(2):140-146.

[16]余智,于民,顧蘇兵,等.[Gly14]-Humanin對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].預(yù)防醫(yī)學(xué),2018,30(1):55-58.

[17]李春雷,黃川鋒,張峰.醒腦靜注射液聯(lián)合醒腦竅法對(duì)腦缺血再灌注大鼠血清及腦組織炎癥因子水平的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2016,32(20):1873-1877.

[18]Nanetti L,Taffi R,Vignini A,et al.Reactive oxygen species plasmatic levelsin ischemic stroke[J].Mol CellΒiochem,2007,303(1-2):19-25.

[19]Galpern WR,Cudkowicz ME.Coenzyme Q treatment of neurodegenerative diseases of aging [J].Mitochondrion,2007,7(Suppl):S146-S153.

[20]Udipi K,Ornberg RL,Thurmond KN,et al.Modification of inflammatory response to implanted biomedical materials in vivo by surface bound superoxide dismutase mimics[J].JΒiomed Mater Res,2000,51(4):549-560.

[21]孔令恒,陳玉龍,孫娜,等.抑制CaMKII減輕線粒體氧化應(yīng)激可改善離體心臟缺血再灌注損傷[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2018,38(2):181-186.

[22]方華,李華鳳,張偉晶,等.腹主動(dòng)脈灌注瑞芬太尼聚己內(nèi)酯減輕脊髓缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2016,33(4):735-740.

[23]Vogt S,Troitzsch D,Abdul-Khaliq H,et al.Heat stress attenuates ATP-depletion and pH-decrease during cardioplegic arrest[J].J Surg Res,2007,139(2):176-181.

[24]Lee I,Salomon AR,Ficarro S,et al.cAMP-dependent tyrosine phosphorylation of subunit Iinhibits cytochrome c oxidase activity[J].JΒiol Chem,2005,280(7):6094-6100.

[25]Yu Q,Nguyen T,Ogbi M,et al.Differential loss of cytochrome-C oxidase subunits in ischemia-reperfusion injury:exacerbation of COI subunit loss by PKC-epsilon inhibition[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2008,294(6):H2637-H2645.

[26]楊柳,許舜軍,曾星,等.人參皂苷Rb_1在大鼠體內(nèi)的藥物代謝研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2006,27(6):1042-1044.

[27]胡錦芳,溫金華,蔣麗華.復(fù)方血栓通片中人參皂苷Rb1與Rg1在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,51(11):6-9.