張仲，羅賢強(qiáng)，周金娜，周小芳，黃明浩，張俊清1，*，羅喻超*

(1.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199)

裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn為馬鞭草科紫珠屬(CallicarpaLinn.)植物，又名趕風(fēng)柴、節(jié)節(jié)紅、百花茶、飯湯葉、亞賽凡等[1]，主要分布于我國(guó)海南，廣西，廣東等地，裸花紫珠是海南常用黎藥材[2]。主要分布于白沙，五指山瓊中等地。裸花紫珠作為藥材四季均可收獲，取裸花紫珠的地上干燥部分，陰干，去除雜質(zhì)用藥，具有抗菌、消炎解毒、收斂止血、祛風(fēng)除濕的功效，臨床上用于急性傳染性肝炎、化膿性炎癥、消化道出血等癥，外用常用于治燒傷、燙傷及外傷出血等?，F(xiàn)代研究表明，裸花紫珠主要含有黃酮、鞣質(zhì)、萜類(lèi)和酚類(lèi)等成分[3-4]，其中的苯乙醇苷類(lèi)化合物毛蕊花糖苷(acteoside，AS)有顯著縮短活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)作用，提示裸花紫珠可能是通過(guò)影響內(nèi)源性凝血途徑來(lái)發(fā)揮止血作用，其中毛蕊花糖苷在藥材中的含有量很高，可能是裸花紫珠止血的主要活性成分[5]。

市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前市場(chǎng)上裸花紫珠制劑已有片劑、膠囊劑、合劑、分散片、栓劑和陰道片劑等劑型[6]，但是缺少用于止血的外用制劑，研制裸花紫珠外用止血貼不僅可以填補(bǔ)市場(chǎng)的空缺，還能通過(guò)貼劑的特點(diǎn)更好發(fā)揮裸花紫珠的止血效果。本論文通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)裸花紫珠的水提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行了工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。用最佳提取工藝所獲得的水提取物進(jìn)行了外用止血實(shí)驗(yàn)，對(duì)止血的效果進(jìn)行了評(píng)估。這些都為將來(lái)裸花紫珠止血貼的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)家兔，購(gòu)買(mǎi)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SDWA-44060506-0403-20170330-00001，雌雄各半，體重2.2～2.5 kg。

1.2 藥物及試劑

裸花紫珠于2016年5月采自海南省白沙縣，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院田建平教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物裸花紫珠CallicarpanudifloraHook.et Arn；吸水墊(7.5 cm×7.5 cm×0.1 cm)購(gòu)買(mǎi)于優(yōu)玖責(zé)任有限公司；云南白藥創(chuàng)可貼(批號(hào)：PJE1628)；甲醇、醋酸、無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)，乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3 儀器

北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司SO9001型電子天平；上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)GXZ-9240型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；上海亞榮生化儀器廠(chǎng)RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。Shimadzu LC-2010AHT高效液相色譜儀(配有紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，LC solution色譜工作站)。

2 方法與結(jié)果

2.1 裸花紫珠提取工藝的考察

2.1.1 浸膏得率的測(cè)定 精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥24 h，迅速轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。計(jì)算浸膏得率。

(1)

2.1.2 毛蕊花糖苷的測(cè)定 依照本實(shí)驗(yàn)室王勇等[7]建立的色譜條件：Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-0.1%醋酸水溶液(15∶85)，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)332 nm，柱溫30 ℃。精密稱(chēng)取毛蕊花糖苷對(duì)照品25.8 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成毛蕊花糖苷濃度為1.032 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。然后分別吸取一定體積的該溶液置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別稀釋成6種濃度分別為0.103 2、0.206 4、0.412 8、0.516 0、0.619 2、0.825 6 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。各濃度的溶液分別進(jìn)樣2 μL，測(cè)定毛蕊花糖苷的峰面積，以毛蕊花糖苷的進(jìn)樣量(μg·μL-1)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=3.574×106X-40 115，r=1.000 0，線(xiàn)性范圍為0.103 2～1.032 μg·μL-1。

取裸花紫珠提取后的濃縮液0.5 mL，置25 mL量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度。取適量，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算毛蕊花糖苷(AS)提取率。

2.1.3 藥材水提取工藝因素與水平 裸花紫珠莖葉中主要的成分毛蕊花糖苷易溶于水，因此采用水加熱回流提取方法，采用蒸餾水回流提取。由于裸花紫珠葉的吸水率較大[7]，故在選擇加水量的水平時(shí)第1次加入量比后兩次大。選取考察加水量，浸泡時(shí)間，提取時(shí)間和提取次數(shù)4個(gè)因素。結(jié)合參考文獻(xiàn)[7-9]，并進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終選取了每個(gè)因素的考察水平，因素水平見(jiàn)表1。

表1 裸花紫珠水提取水平因素表

2.1.4 提取工藝正交試驗(yàn)方法 取裸花紫珠地上干燥部分，將莖葉剪成均一大小，分成9份，每份約20 g，依次編號(hào)為1～9組。按照表2中L9(34)正交表規(guī)定的條件進(jìn)行回流提取，提取液用200目紗布過(guò)濾，濃縮，待濃縮液冷卻后，加蒸餾水定容到100 mL，搖勻。按照2.1.1和2.1.2所述方法測(cè)定浸膏得率和毛蕊花糖苷含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2及表3。

表2 提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

注：綜合評(píng)分=(浸膏得率/19.60×0.3+AS得率/1.77×0.7)×100。

表3 方差分析表

比較各因素的極差可知，因素D(提取次數(shù))對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大，其次是C、B和A，所以因素對(duì)綜合評(píng)分值指標(biāo)影響大小排序?yàn)镈>C>B>A。由方差分析可知，因素D具有顯著性差異。根據(jù)極差分析各因素的均值，可確定裸花紫珠藥材水提取最佳工藝為A2B3C2D3，即藥材浸泡時(shí)間2 h后，提取3次，加水量分別為12，10，10倍量，每次提取時(shí)間為1 h。

2.1.5 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取裸花紫珠藥材3份，每份50 g，按上述確定的最佳工藝條件提取，對(duì)藥材水提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，由上述確定的最佳方案提取毛蕊花糖苷的提取率較高，該方案較為穩(wěn)定。

表4 水提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

2.2 藥效學(xué)評(píng)價(jià)

采用最佳提取工藝提取獲得的流浸膏旋蒸濃縮，分別稀釋至浸膏濃度為1.0、0.5 g·mL-1。吸取一種濃度的流浸膏1mL均勻分布于吸水棉墊2.4 cm×1.5 cm×0.1 cm后，50 ℃減壓烘干1 h，分別制成高低兩種含藥濃度的止血棉墊，記錄各棉墊的的質(zhì)量。進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)[10-11]，選取市售的云南白藥創(chuàng)可貼為陽(yáng)性藥。結(jié)果如表5所示，顯示云南白藥創(chuàng)可貼組的平均出血時(shí)間與0.5 g·mL-1組相當(dāng)，而平均出血量要低于1.0 g·mL-1組。

表5 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參考預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，制得含藥濃度分別為0.5、1.0、2.0 g·mL-1的低中高三種止血棉墊。取成年家兔15只，隨機(jī)分為5組，低、中、高劑量組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。將家兔左耳與右耳對(duì)齊，于耳緣末端2/3、1/2、1/3處，用一次性采血針對(duì)家兔耳緣靜脈穿刺1 cm，形成靜脈出血后立即在出血處敷以制好的止血棉墊，并用100 g砝碼壓在棉墊上，5 s觀(guān)察1次出血情況，直至出血停止。記錄出血時(shí)間，并稱(chēng)量止血棉墊的質(zhì)量，計(jì)算出血量。

結(jié)果見(jiàn)表6和表7。

表6 出血時(shí)間結(jié)果

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表7 出血量結(jié)果

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01。

與空白組相比，裸花紫珠低、中、高劑量與云南白藥創(chuàng)可貼均可以非常顯著地減少出血量(P<0.01)，其中高劑量組的出血量要低于陽(yáng)性對(duì)照組；此外，高劑量組相較空白組也可以明顯地減少出血時(shí)間(P<0.01)，同時(shí)高劑量的出血時(shí)間也要低于陽(yáng)性對(duì)照組。綜上，說(shuō)明裸花紫珠水提取物具有一定的外用止血作用，具有開(kāi)發(fā)成外用止血貼劑的潛力。

3 討論

在正交試驗(yàn)分析中，引進(jìn)綜合評(píng)價(jià)的理念，使用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法可以避免單一評(píng)價(jià)的片面性，使分析結(jié)果更加科學(xué)、客觀(guān)，使得提取工藝趨于合理、可信[12]。本研究以浸膏得率、毛蕊花糖苷的提取得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)裸花紫珠葉中苯乙醇苷類(lèi)成分的水提取工藝進(jìn)行研究，確定了最佳的提取工藝：藥材加水浸泡2 h，提取3次，加水倍量分別為12、10、10，每次提取1 h。本研究確定的提取工藝簡(jiǎn)單可行，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好，可為今后裸花紫珠莖葉的水提取提供參考，也為日后裸花紫珠制劑的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

本文進(jìn)一步針對(duì)最佳提取工藝所獲得的裸花紫珠浸膏，進(jìn)行了外用止血藥效學(xué)的研究。以出血時(shí)間和出血量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，先進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)。參考預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，考察不同劑量對(duì)家兔耳緣靜脈出血的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)量、樣本量以及實(shí)驗(yàn)方法都相同，且結(jié)果基本在同一水平，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有較好的重復(fù)性。此次研究，初步證明本浸膏具有一定的外用止血作用，尤其以2.0 g·mL-1的濃度給藥時(shí)，作用效果十分顯著，甚至要優(yōu)于市售的云南白藥創(chuàng)可貼，表明了本浸膏作為外用止血藥物開(kāi)發(fā)的潛力。本次研究，參考止血貼的制作流程，并采用了相應(yīng)的材料，這也為裸花紫珠外用止血貼的研制提供了基礎(chǔ)。

[1] 陳保.HPLC-DAD測(cè)定裸花紫珠中木樨草苷和毛蕊花糖苷[J].新中醫(yī)，2015，47(7)：275-276.

[2] 王艷.裸花紫珠的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，23(35)：3983-3985.

[3] 周志強(qiáng).裸花紫珠化學(xué)成分的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2013.

[4] 黃波.裸花紫珠化學(xué)成分及其膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2014.

[5] 張潔，李寶泉，馮鋒，等.裸花紫珠的化學(xué)成分及其止血活性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35(24)：3297-3301.

[6] 劉小芬，李順祥.裸花紫珠研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2015，13(4)：396-402.

[7] 王勇，文菀，李永輝.正交試驗(yàn)優(yōu)選裸花紫珠葉中苯乙醇苷類(lèi)成分的水提取工藝[J].中成藥，2015，37(8)：1856-1858.

[8] 劉德賢，陶遵威.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選調(diào)經(jīng)顆粒的提取工藝[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，32(3)：195-197.

[9] 趙明德，肖順漢，孫琴，等.金釵石斛保健酒增強(qiáng)機(jī)體免疫力的篩選研究[J].釀酒科技，2016(4)：77-80.

[10] 王巍，程明和，高靜，等.白及止血海綿止血作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2016，34(1)：32-35，65.

[11] 康佐文，宋國(guó)明，周文麗，等.立止血對(duì)家兔止血效果的研究[J].蛇志，2000，12(2)：8-10.

[12] 張躍，焦連慶，于敏，韓梅.多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選蜂膠總黃酮提取工藝研究[J].中國(guó)藥師，2012，15(6)：759-762.