陳康，劉娟，周修騰，紀(jì)瑞鋒，童宇茹，3，陳同，袁媛*

(1.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230038；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

人參花為五加科人參屬植物人參PanaxginsengC.A.Meyer的干燥花蕾，具有補(bǔ)氣強(qiáng)身、抵抗疲勞、延緩衰老的作用[1]。研究表明，人參花中含有20多種皂苷活性物質(zhì)、17種氨基酸、11種微量元素、3種抗癌活性蛋白、多種生物活性揮發(fā)油等[2-3]，具有藥品及保健品開發(fā)潛力；同時(shí)，人參主要活性成分人參皂苷在人參花中含量高達(dá)5%～7%，是人參根的5～6倍[4]，且從人參花中分離得到了多種具有生物活性的新穎結(jié)構(gòu)人參皂苷[5-7]。近年來(lái)，隨著新藥源的拓展研究，有關(guān)于人參花的藥理、藥化、提取工藝報(bào)道越來(lái)越豐富，但尚未見到有關(guān)人參花的內(nèi)源植物激素報(bào)道。

植物內(nèi)源性激素是植物體內(nèi)重要的信號(hào)分子，其分布具有明顯的組織特異性，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)控制作用。其中，生長(zhǎng)素(如：IBA、IAA、NAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)參與了多個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如種子萌發(fā)、休眠、植物生長(zhǎng)、開花、葉片衰老脫落等；茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)作為脅迫激素，受到生物脅迫和非生物脅迫的調(diào)控，增強(qiáng)植物的抗逆性，在植物的脅迫耐受性和抗性中發(fā)揮著重要作用[8-10]。研究表明，以上5種植物激素對(duì)藥用植物次生代謝調(diào)控均具有重要意義。其中IBA可以提高匍枝筋骨草β-脫皮甾酮的含量[11]，GA可以誘導(dǎo)丹參毛狀根酚酸類物質(zhì)的積累[12]，ABA可以調(diào)控滇紫草細(xì)胞紫草寧生物合成[13]，JA與SA可促進(jìn)白木香懸浮細(xì)胞的倍半萜生物合成[14-15]等。

植物激素對(duì)人參皂苷的合成具有重要的調(diào)控意義[16-18]，但有關(guān)人參內(nèi)源性激素的研究較少，而在人參花中內(nèi)源性植物激素的分布尚未見報(bào)道。本研究根據(jù)課題組前期建立的激素測(cè)定方法[19]，采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對(duì)人參花中5種內(nèi)源性植物激素ABA、GA3、IAA、JA、SA進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)還對(duì)JA前體12-氧-二烯酸(OPDA)和JA活性形式JA-異亮氨酸(JA-ile)含量進(jìn)行測(cè)量分析，旨在為揭示內(nèi)源性植物激素對(duì)人參花中次生代謝的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

供試人參幼苗，由康美新開河種植基地提供，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心黃璐琦研究員鑒定為人參PanaxginsengC.A.Mey.的幼苗。

1.2 儀器

AB Sciex公司QTRAP?6500三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)；美國(guó)Thermo Scientific公司Millipore超純水系統(tǒng)；BT-224S型萬(wàn)分之一電子分析天平；THZ-C-1全溫震蕩搖床；5810R高速冷凍離心機(jī)。

1.3 試劑

生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸等對(duì)照品，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜純乙腈、甲酸購(gòu)自Fisher公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，超純水自制。

2 方法

2.1 激素提取方法

分別收集新鮮的人參花，液氮冰浴研磨，準(zhǔn)確稱取根和葉片各0.1 g到5 mL離心管中，加入異丙醇：水：HCl(2∶1∶0.002)提取液1 mL，4 ℃，100 r·min-1搖床中振動(dòng)30 min，取出離心管后加入2 mL二氯甲烷，再次振動(dòng)30 min；4 ℃，13 000 r·min-1冷凍離心5 min，吸取有機(jī)相層溶液1.8 mL，氮?dú)獯蹈?，加?0%甲醇-水溶液400 μL，4 ℃，13 000 r·min-1冷凍離心15 min，吸取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters ACQUITYUPLCBEH C18色譜柱(2.1 mm YUPLCB，1.71 mm)，流動(dòng)相：0.05%甲酸水-乙腈溶液。線性洗脫梯度：0～0.3 min，10%乙腈；0.3～3 min，10%～60%乙腈；3～6 min，60%～95%乙腈；6～6.2 min，10%乙腈。流速為0.6 mL·min-1，柱溫40 ℃，樣品盤溫度4 ℃，進(jìn)樣量10 μL，分析時(shí)間7 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為負(fù)離子掃描；監(jiān)測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣的壓力為30 psi，離子化電壓為-4500 V，離子源溫度550 ℃，噴霧氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為50 psi，數(shù)據(jù)處理用MultiQuant定量軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果及分析

3.1 專屬性檢測(cè)

配置內(nèi)源性植物激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2項(xiàng)下的質(zhì)譜-色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，人參花的內(nèi)源性植物激素峰型單一、分離度較高，且均在5 min以內(nèi)出峰，實(shí)現(xiàn)了植物激素準(zhǔn)確快速測(cè)定的目的，適用于人參花中激素含量的測(cè)定(見圖1)。

注：A：IBA標(biāo)準(zhǔn)品；B：GA3標(biāo)準(zhǔn)品；C：ABA標(biāo)準(zhǔn)品；D：人參花IBA樣品；E：人參花GA3樣品；F：人參花ABA樣品；G：SA標(biāo)準(zhǔn)品；H：JA-ile標(biāo)準(zhǔn)品；I：OPDA標(biāo)準(zhǔn)品；J：人參花SA樣品；K：人參花JA-ile樣品；L：人參花OPDA樣品。圖1 內(nèi)源性植物激素選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖

3.2 人參花中5種內(nèi)源激素含量檢測(cè)及分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)人參花中內(nèi)源性植物激素含量進(jìn)行分析，每種激素平行5個(gè)樣品。表1為人參花中5種內(nèi)源性植物激素含量的檢測(cè)結(jié)果。由結(jié)果可以看出，人參花中含有較多抗逆激素SA與ABA，研究也表明水楊酸可以誘導(dǎo)植物開花、促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)[20]，而ABA對(duì)植物成花的誘導(dǎo)和發(fā)育具有重要調(diào)控作用[21]；而與植物向性生長(zhǎng)相關(guān)的IBA及伸長(zhǎng)生長(zhǎng)相關(guān)的GA3含量較低，研究表明植物中越是代謝旺盛的器官生長(zhǎng)素與赤霉素含量越高，說(shuō)明人參花的代謝速度較慢；而茉莉酸JA在人參花中含量極低(低于檢測(cè)限以下)，因此有必要對(duì)JA激素合成通路相關(guān)的前體及活性成分進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)分析(圖2)。

表1 人參花中內(nèi)源性植物激素含量

圖2 人參花5種內(nèi)源性植物激素含量比例分析

3.3 人參花中JA合成通路關(guān)鍵成分的分析

JA生物合成通路主要分成三個(gè)階段：(1)在質(zhì)體中，由甘油酯轉(zhuǎn)變?yōu)镺PDA；(2)在過(guò)氧化物酶體中，OPDA轉(zhuǎn)變?yōu)檐岳蛩?JA)；(3)在胞質(zhì)溶膠中，JA轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问降能岳蛩崤c異亮氨酸的偶聯(lián)物(JA-ile)(圖3)。JA在不同組織的差異性積累導(dǎo)致了特異性的基因調(diào)控效應(yīng)[22]。在對(duì)模式植物擬南芥和番茄的研究中，JA被認(rèn)為通過(guò)調(diào)控水運(yùn)輸?shù)交ㄋ幒突ńz的過(guò)程來(lái)調(diào)控花藥的開裂和衰老，從而達(dá)到調(diào)控開花時(shí)間的作用[23-24]。在對(duì)水稻、小麥、黑麥和高粱等禾本科植物的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性JA也參與穎花開放的調(diào)控[25]。從我們的數(shù)據(jù)中可以看到存在大量的JA前體OPDA，這種現(xiàn)象既是為了可能的應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)大量JA信號(hào)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也是開花期植物花中JA組成性表達(dá)的必然結(jié)果。JA及其衍生物主要的活性物質(zhì)MeJA、JA-ile早就被證明是人參皂苷合成通路上非常有效的化學(xué)誘導(dǎo)子[26]，往往都是通過(guò)刺激合路上關(guān)鍵酶基因[27]或是調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]。其中用外源100 μM MeJA處理人參不定根，參與人參皂苷生物合成基因如HMGR、SS、SE和DDS有明顯上調(diào)，而CAS略有下降[29]。我們的數(shù)據(jù)中JA和JA-ile的含量水平不高，考慮到激素本身作用就是具有級(jí)聯(lián)放大的作用效果，維持較低的濃度才是穩(wěn)態(tài)。

圖3 人參花中JA合成通路含量分析

4 討論

內(nèi)源性激素對(duì)于藥用植物的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物(多數(shù)為藥效成分)的含量具有重要的調(diào)控作用，植物內(nèi)源性激素作為天然生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，參與了多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程并調(diào)控植物的次生代謝。

本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性植物激素可能參與調(diào)控了人參開花過(guò)程以及花中人參皂苷的積累。前人研究表明，內(nèi)源性激素對(duì)植物開花過(guò)程存在調(diào)控[30-32]。ABA對(duì)刺梨Rosaroxburghii[33]、銀杏GinkgobilobaL.[34]、荔枝Litchichinensis[35]、蝴蝶蘭(Phalaenopsishybrida)[36]等花的形成起促進(jìn)作用[37]。2004年，Ulger 等的研究結(jié)果顯示在花誘導(dǎo)和起始階段高濃度的ABA對(duì)花的形成起促進(jìn)作用[38]。中藥領(lǐng)域中，在石斛DendrobiumcandidumWall.ex Lindl.離體培養(yǎng)的研究中也發(fā)現(xiàn)，原球莖在ABA培養(yǎng)基上預(yù)處理15d再轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，花芽形成頻率明顯提高，且單株花數(shù)增加[39]；同時(shí)，人參皂苷也在人參的花蕾中含量相對(duì)較高[40]，植物激素和人參花中皂苷合成和積累可能存在一定相關(guān)性：而SA和JA都對(duì)人參皂苷合成起到調(diào)控作用[41]。從內(nèi)源性植物激素對(duì)中藥的次生代謝的影響來(lái)說(shuō)，ABA促進(jìn)黃花蒿中青蒿素的含量[42]，JA也對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)生重要影響[43]。因此，內(nèi)源性植物激素對(duì)人參的生長(zhǎng)及次生代謝的調(diào)控影響值得深入討論，同時(shí)內(nèi)源性植物激素對(duì)中藥質(zhì)量的影響及具體機(jī)制的研究有待今后的進(jìn)一步研究。

[1] 林楠，鐘琳琳，李娜，等.人參花提取物抗疲勞作用的研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(3)：336-337.

[2] 王恩鵬.人參花揮發(fā)油的質(zhì)譜研究[D].長(zhǎng)春：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[3] 潘小玲，李振麟，錢士輝，等.中國(guó)人參花化學(xué)成分研究[J].中國(guó)野生植物資源，2014，33(2)：13-15.

[4] Ko S K，Cho O S，Bae H M，et al.Quantitative analysis of ginsenosides composition in flower buds of various ginseng plants[J].Appl Bio Chem，2011，54(1)：154-157.

[5] Yoshikawa M，Sugimoto S，Nakamura S，et al.Medicinal flowers.XVI.New dammarane-type triterpene tetraglycosides and gastroprotective principles from flower buds ofPanaxginseng[J].Chem Pharm Bull，2007，55(7)：1034-1038.

[6] Tung N H，Song G Y，Nhiem N X，et al.Dammarane-type saponins from the flower buds ofPanaxginsengand their intracellular radical scavenging capacity[J].J Agric Food Chem，2010，58(2)：868-874.

[7] 徐斐，李珂珂，陳麗榮，等.人參花醇提物中的皂苷類化學(xué)成分[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18(1)：67-71.

[8] Duy N，Ivo R，Celestina M，et al.How plants handle multiple stresses：hormonal interactions underlying responses to abiotic stress and insect herbivory[J].Plant Mol Biol，2016，91(6)：727-740.

[9] Campos-Rivero G，Osorio-Montalvo P，Sánchez-Borges R，et al.Plant hormone signaling in flowering：An epigenetic point of view[J].J Plant Physiol，2017(214)：16-27.

[10] Eremina M，Rozhon W，Poppenberger B.Hormonal control of cold stress responses in plants[J].Cell Mol Life Sci，2016，73(4)：797-810.

[11] 趙曉杰，李曉燦，宇佳，等.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)方式對(duì)匍枝筋骨草生根及β-蛻皮激素量的影響[J].中草藥，2011，42(9)：1828-1832.

[12] 崔北米.ABA、GA3和乙烯利誘導(dǎo)丹參毛狀根酚酸類物質(zhì)的積累研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[13] 師帥.脫落酸(ABA)對(duì)滇紫草細(xì)胞次生代謝影響的研究[D].南京：南京大學(xué)，2005.

[14] 劉娟.程序性細(xì)胞死亡與沉香倍半萜次生代謝關(guān)系的探索研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2015.

[15] 蔣研風(fēng)羊.MeJA誘導(dǎo)白木香不定根產(chǎn)生倍半萜類物質(zhì)的研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[16] 李世昌.植物激素在人參生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].植物雜志，1990(4)：31-33.

[17] Park，李方元.人參根中植物激素類物質(zhì)活性的季節(jié)變化[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，1989(2)：42.

[18] 周倩耘，丁家宜，劉峻，等.植物激素對(duì)人參毛狀根生長(zhǎng)和皂甙含量的影響[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2003，12(1)：26.

[19] 周修騰，康利平，李鵬英，等.UPLC-MS/MS測(cè)定AM真菌侵染丹參植物ABA含量[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，12：92.

[20] 齊秀東.水楊酸對(duì)植物的生理作用[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，21(1)：74-78.

[21] 徐平珍，劉濤，楊瑩，等.脫落酸在植物花發(fā)育過(guò)程中的作用[J].云南植物研究，2007，29(2)：215-222.

[22] Hause B，Stenzel I，Miersch O，et al.Tissue-specific oxylipin signature of tomato flowers-allene oxide cyclase is highly expressed in distinct flower organs and vascular bundles[J]. Plant J.2000(24)：113-26.

[23] Ishiguro S，Kwai-Oda A，Ueda J，et al.The DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCIENCE gene encodes a novel phospholipase A1 catalyzing the initial step of jasmonic acid biosynthesis，which synchronizes pollen maturation，anther dehiscence，and flower opening in Arabidopsis[J].Plant Cell，2001(13)：2191-2209.

[24] Li L，McCaig B，Wingerd B，et al.The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation，jasmonate-signaled defense responses，and glandular trichome development[J].Plant Cell，2004(16)：126-143.

[25] 何永明，林擁軍，曾曉春.水稻穎花自然開放過(guò)程中茉莉酸(JA)生物合成的變化[J].作物學(xué)報(bào)，2012，(10)：1891-1899.

[26] Bae K H，Choi Y E，Shin C G，et al.Enhanced ginsenoside productivity by combination of ethephon and methyl jasmoante in ginseng(PanaxginsengC.A.Meyer)adventitious root cultures[J].Biotechnol Lett，2006，28(15)：1163-1166.

[27] Qian Z G，Zhao Z J，Xu Y，et al.Novel chemically synthesized hydroxyl-containing jasmonates as powerful inducing signals for plant secondary metabolism[J].Biotechnol Bioeng，2004，86(7)：809-816.

[28] Ali M B，Yu K W，Hahn E J，et al.Methyl jasmonate and salicylic acid elicitation induces ginsenosides accumulation，enzymatic and non-enzymatic antioxidant in suspension culturePanaxginseng，roots in bioreactors[J].Plant Cell Reports，2006，25(6)：613-620.

[29] Kim Y S，Yeung E C，Hahn E J，et al.Combined effects of phytohormone，indole-3-butyric acid，and methyl jasmonate on root growth and ginsenoside production in adventitious root cultures ofPanaxginsengC.A.Meyer[J].Biotechnol Lett，2007，29(11)：1789.

[30] Marschmartínez N，De F S.Hormonal control of the development of the gynoecium[J].Current Opinion in Plant Biology，2016(29)：104-114.

[31] Okada K，Ueda J，Komaki M K，et al.Requirement of the auxin polar transport system in early stages ofArabidopsisfloral bud formation[J].Plant Cell，1991，3(7)：677.

[32] Mouradov A，Cremer F，Coupland G.Control of flowering time：interacting pathways as a basis for diversity[J].Plant Cell，2002(14)：S111.

[33] 樊衛(wèi)國(guó)，劉國(guó)琴，安華明，等.刺梨花芽分化期芽中內(nèi)源激素和碳、氮營(yíng)養(yǎng)的含量動(dòng)態(tài)[J].果樹學(xué)報(bào)，2003，20(1)：40.

[34] 史繼孔，張萬(wàn)萍.銀杏雌花芽分化過(guò)程中內(nèi)源激素含量的變化[J].園藝學(xué)報(bào)，1999，26(3)：194.

[35] Cui Z，Zhou B，Zhang Z，et al.Abscisic acid promotes flowering and enhances LcAP1，expression inLitchichinensis，Sonn[J].South Afr J Bot，2013，88(9)：76.

[36] Wang W Y，Chen W S，Chen W H，et al.Influence of abscisic acid on flowering inPhalaenopsishybrida[J].Plant Physiol Biochem，2002，40(1)：97.

[37] 趙家昱，潘遠(yuǎn)智，李永紅.外源ABA對(duì)葉子花開花及內(nèi)源ABA合成關(guān)鍵酶的影響[J].園藝學(xué)報(bào)，2014，41(10)：2085.

[38] Ulger S，Sonmez S，Karkacier M，et al.Determination of endogenous hormones，sugars and mineral nutrition levels during the induction，initiation and differentiation stage and their effects on flower formation in olive[J].Plant Growth Regul，2004(42)：89.

[39] 王光遠(yuǎn)，劉培，許智宏，等.石斛離體培養(yǎng)中ABA對(duì)誘導(dǎo)花芽形成的影響[J].植物學(xué)報(bào)，1995(5)：374.

[40] Kim Y J，Zhang D，Yang D C.Biosynthesis and biotechnological production of ginsenosides[J].Biotechnol Adv，2015(33)：717.

[41] Gutjahr C，Paszkowski U.Weights in the balance：jasmonic acid and salicylic acid signaling in root-biotroph interactions[J].Mol Plant Microbe Interact，2009，22(7)：763-772.

[42] 何軍.SA與ABA調(diào)節(jié)青蒿素的生物合成及青蒿副產(chǎn)物的綜合利用[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[43] 田嬌，劉園，房敏峰.外源茉莉酸類激素對(duì)藥用植物次生代謝的影響研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27(1)：185-190.