何 洋，高 揚，曹 芳，張 強，陳 偉，冉啟山，劉喜平，楊 露，姚聲濤

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是神經(jīng)科常見的疾病，其發(fā)病率約占全部腦血管疾病的35%，是腦血管最重要疾病之一，全球每年約有300萬新發(fā)的ICH患者，其發(fā)病率、致死致殘率極高，遠(yuǎn)超其他種疾病對人群造成的危害，ICH后存活的患者均會出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙[1]。盡管目前ICH的致病機制的研究已取得了顯著進展，臨床有許多關(guān)于ICH藥物治療和手術(shù)治療的研究，但到目前為止仍缺乏公認(rèn)有效的治療措施。ICH誘發(fā)的繼發(fā)性炎癥損傷造成神經(jīng)元凋亡，在神經(jīng)功能缺損中發(fā)揮著重要的作用，因此干預(yù)ICH神經(jīng)元的凋亡是治療ICH的重要措施之一。蝦青素(3，3’-二羥基-β，β-胡蘿卜素-4，4’-二酮；AST)在自然界廣泛分布，是主體甲殼類動物的色素，如鮭魚等生物[2]。蝦青素于1987年被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)為飼料添加劑，1999年被批準(zhǔn)為膳食補充劑[3]。近年來，許多關(guān)于蝦青素的體外和體內(nèi)研究試驗中證明其抗氧化作用，例如對單線態(tài)氧的猝滅作用，對超氧化物、過氧化氫和羥基自由基的強烈清除作用以及對脂質(zhì)的抑制作用過氧化[4，5]；除此之外，蝦青素的其他幾種生物活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗糖尿病，免疫調(diào)節(jié)活性和神經(jīng)保護作用也已有報道[2]。蝦青素具有廣泛的藥理活性，其中神經(jīng)保護作用頗受研究人員關(guān)注，蝦青素藥動學(xué)研究表明，蝦青素可以定位于脂質(zhì)膜表面或者穿過脂質(zhì)膜AD[6]，同時在嚙齒動物中可以通過血腦屏障，從而對神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有較好的功效。研究發(fā)現(xiàn)蝦青素可改善由脂多糖誘發(fā)的小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，顯著抑制大腦中的IL-1α、IL-6和TNF-α的表達(dá)[7，8]。蝦青素治療與降低的皮質(zhì)損傷體積、神經(jīng)元損失和皮質(zhì)中的神經(jīng)變性相關(guān)，這可能通過模擬神經(jīng)營養(yǎng)因子和促進突觸存活而發(fā)生。蝦青素對小鼠ICH的神經(jīng)保護的影響尚未見報道，因此本研究以炎癥和凋亡為切入點，采用小鼠自體尾血定位注射建立尾狀殼核腦出血模型，進一步研究蝦青素對ICH的保護作用的靶點，觀察蝦青素改善ICH小鼠神經(jīng)炎癥損傷的作用是否與抑制炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子IL-1β和TNF-α以及凋亡基因Caspase-3的有關(guān)，為進一步研究蝦青素在ICH的繼發(fā)性的炎性損傷提供藥理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物為清潔級C57BL/6小鼠，雄性，6～8周齡，16～20 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(渝)20120913。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院SPF級實驗動物中心，飼養(yǎng)條件是光照時間7：00-19：00，黑暗時間19：00～7：00，相對空氣濕度45%～55%，溫度22～26 ℃，可自由進食進水。

1.2 主要藥品與試劑 蝦青素(美國Santa Cruz公司)；DW-2000腦立體定位儀(成都泰盟公司)；IL-1β、TNF-α和Caspase-3 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)；NeuN兔抗小鼠和Caspase-3兔抗小鼠單克隆抗體(美國Abcam公司)；羊抗兔IgG二抗、TUNEL試劑盒、ELISA試劑盒和Hoeschst染料(美國Invitrogen公司)；Neuronal Medium-basal培養(yǎng)基，高糖DMEM和FBS(美國Gibco公司)。

1.3 小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取18 d胎齡的C57小鼠，顯微鏡下剝?nèi)√ナ蟠竽X前皮質(zhì)，去除腦膜和血管。眼科剪剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm，0.125%胰蛋白酶37 ℃孵育10 min，吹打15～20次，2500 r/min離心10 min。棄上清液，用完全培養(yǎng)基含10%胎牛血清、2 μmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，計數(shù)細(xì)胞至5×105個/ml，接種于多聚-L-賴氨酸(Poly-L-Lysine)包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中。置于37 ℃、含5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液至含2% B27、0.4×10-4mol/L阿糖胞苷(Ara-C)和0.5 mM谷氨酰胺Neuronal Medium-basal培養(yǎng)基，以后每隔72 h半量換液，培養(yǎng)至8 d。實驗分組：(1)空白對照組為生理鹽水組；(2)實驗組為2個AST濃度組(10-4和10-5mol/L)，加入20 μmol/L Hb至培養(yǎng)液中；(3)實驗對照組為Hb 20 μmol/L Hb處理。

1.4 小鼠ICH模型的制備 C57小鼠用10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉注射，俯臥固定于小鼠大腦立體定位儀上，頭皮酒精消毒，暴露頂骨，取尾動脈血50 μl，用注射泵(5 μl/min)注射至左腦紋狀體(小鼠前囟右側(cè)2.5 mm，向前0.2 mm，向腹側(cè)3.5 mm)；注射后針頭停留8～10 min，拔出針頭用醫(yī)用骨蠟封閉注射孔，縫合頭皮切口。假手術(shù)組以同樣的方法注射等量生理鹽水。

1.5 分組與給藥 實驗分組為假手術(shù)組、ICH模型組、10 mg/kg和30 mg/kg AST治療組，各6只小鼠。各組做腦出血手術(shù)，于2 h、12 h、24 h、48 h連續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物(AST用1 ml/kg橄欖油溶解配制，假手術(shù)組和ICH模型組小鼠僅給予連續(xù)橄欖油灌胃處理)，每天1次。

1.6 腦出血小鼠神經(jīng)功能缺損評分(NDS) 將24只小鼠隨機分為4組。各組術(shù)后連續(xù)給藥后，并于給藥后的1 d、3 d、5 d、7 d參照文獻(xiàn)[9]對各處理組小鼠作神經(jīng)功能缺損程度評分，神經(jīng)功能評分在2級以上的小鼠視為ICH模型成功，納入實驗研究對象，剔除評分在0級或4級以上的模型小鼠。主要包括行走測試、提尾反射、平衡測試、感覺測試、反射缺失和反常運動。最大得分為18分，輕型傷：1～6分；中型傷：7～12分；重型傷：13～18分。

1.7 ELISA法測定ICH血腫周圍組織中TNF-α、IL-1β和Caspase-3的含量 取假手術(shù)組、ICH模型組、AST不同劑量治療組小鼠在ICH在不同時間點腦血腫灶周組織0.5 g，加入預(yù)冷的PBS，使制成質(zhì)量濃度為10%的腦組織勻漿，4 ℃，4000 r/min，離心15 min，置-70 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA檢測組織勻漿液中的TNF-α、IL-1β和Caspase-3的表達(dá)變化情況。

1.8 腦組織病理學(xué)檢查 各組分別于1 d、3 d各取3只小鼠，4%多聚甲醛灌流固定后取出腦組織后4 ℃繼續(xù)相同的方法固定24 h以上，20%和30%的庶糖梯度脫水，采用冷凍切片的方法，給予腦片冰凍切片漂片法作神經(jīng)元染色。在光學(xué)顯微鏡(10×20)下，隨機選取5個高倍視野，陽性為紅色神經(jīng)元胞核，計數(shù)陽性染色神經(jīng)元數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 AST提高了Hb誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的存活率 通過神經(jīng)原代培養(yǎng)實驗考察10-4mol/L和10-5mol/L AST對Hb誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護作用。前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)AST對神經(jīng)元生長無影響，在36 h觀察期內(nèi)神經(jīng)元存活率一直穩(wěn)定在80%；相較于對照組，在光鏡下觀察TUNEL和Caspase-3凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，模型組(Hb組)神經(jīng)元在36 h后存活率顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。同時給予神經(jīng)元10-4mol/L和10-5mol/L AST后，與模型組(Hb組)比較36 h后AST組神經(jīng)元存活率得到顯著提高，TUNEL陽性和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明AST對Hb誘導(dǎo)原代神經(jīng)元細(xì)胞損傷能顯著提高原代神經(jīng)元細(xì)胞活力，具有明顯神經(jīng)保護作用(見圖1)。

2.2 AST對腦出血小鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響 神經(jīng)功能缺損程度評分(NDS)是評估小鼠ICH后損傷程度的重要參考指標(biāo)模型組的NDS顯著均顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，ICH模型制備成功；30 mg/kg組在給藥后的1 d、3 d均能明顯改善小鼠的神經(jīng)功能缺損(P<0.05)，而10 mg/kg組只在給藥后3 d能顯著降低腦出血小鼠NDS(P<0.05)(見圖2)。

A：TUNEL染色；B：Caspase-3染色；C：不同劑量Ica組TUNEL和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的比較。a-對照組；b-Hb組；c-AST(10-4mol/L)組；d - AST(10-5mol/L)組(n=4)。與對照組比較a：P<0.01；與Hb組比較b：P<0.05，c：P<0.01
圖1 AST對Hb誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元保護作用(×200)

與假手術(shù)組組比較a：P<0.01；與ICH模型組比較b：P<0.05圖2 各組不同時間腦出血小鼠神經(jīng)功能評分比較

2.3 AST對ICH小鼠血腫灶周圍組織中TNF-α、IL-1β和Caspase-3表達(dá)的影響 ELISA法檢測小鼠ICH后血腫周圍組織的TNF-α、IL-1β和Caspase-3的蛋白表達(dá)變化。假手術(shù)組和ICH模型組結(jié)果見圖3，由圖3可以看出，TNF-α、IL-1β和Caspase-3在小鼠ICH血腫周圍組織的蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)，并且在3 d達(dá)到最大值。與ICH組比較，30 mg/kg的AST在出血后的1 d、3 d能顯著抑制TNF-α、IL-1β和Caspase-3的表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01)，在出血后的5 d能顯著抑制Caspase-3的表達(dá)水平(P<0.01)；10 mg/kg在出血后的1 d能顯著抑制TNF-α、IL-1β和Caspase-3的表達(dá)水平(P<0.05)，在出血后的3 d能顯著抑制TNF-α和Caspase-3的表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01)，在出血后的5 d能顯著抑制IL-1β的表達(dá)水平(P<0.05)(見圖3)。

2.4 腦組織病理學(xué)改變 假手術(shù)組小鼠腦組織各腦區(qū)結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，手術(shù)后各時間段均未見神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞浸潤；造模后3 d，與AST組比較，ICH模型組出血灶周圍神經(jīng)元胞體大小不一、形態(tài)各異。與ICH模型組，AST治療組神經(jīng)元數(shù)量在腦出血后各時間點的計數(shù)皆顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；造模后3 d時，AST治療組神經(jīng)元數(shù)量明顯多于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖4)。

A：TNF-α；B：IL-1β；C：Caspase-3。與假手術(shù)組比較a：P<0.01；與ICH模型組比較b：P<0.05，c：P<0.01

3 討 論

血腫灶周圍過度的炎癥反應(yīng)是ICH后繼發(fā)性損傷最重要致病機制之一，其主要表現(xiàn)是血腫灶周小膠質(zhì)細(xì)胞的大量活化和釋放多種炎性因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β等)進而加加劇了神經(jīng)元炎性損傷[10]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的最主要效應(yīng)蛋白，其在ICH的神經(jīng)變性凋亡的致病過程中起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素對多種中樞系統(tǒng)疾病(腦梗死、脊髓損傷、腦創(chuàng)傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血和帕金森病)的疾病動物模型中均有顯著的改善作用[11～15]。其作用機制有抗炎抗氧化應(yīng)激，促進海馬神經(jīng)發(fā)生和可塑性，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活性等[16]。蝦青素能抑制LPS誘導(dǎo)的ICR小鼠海馬腦區(qū)的TNF-α、IL-1β及環(huán)氧化酶等炎癥因子的蛋白表達(dá)，改善其學(xué)習(xí)記憶和空間認(rèn)知能力[17]。蝦青素是否能抑制ICH后繼發(fā)性腦炎癥損傷，目前尚未見文獻(xiàn)報道。TNF-α和IL-1β在ICH血腫灶周圍的神經(jīng)元的變性凋亡中起著重要的作用。TNF-α是ICH后升高得最快的炎性因子，可引起IL-1β，IL-6的級聯(lián)反應(yīng)[18]。TNF-α可誘導(dǎo)IL-1β大量表達(dá)，后者可通過NF-κB細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑激活血腫灶區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化并分泌大量的炎癥因子，加劇了局部腦組織炎性損害[18]。TNF-α還能夠激活基質(zhì)金屬蛋白酶-9細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，增加腦出血后血腦屏障的通透性，加劇了組織水腫，導(dǎo)致灶周神經(jīng)元大量變性凋亡[19]。IL-1β誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間粘附分子等活化，引起血腫周圍組織的炎性細(xì)胞浸潤。另外，IL-1β還可以下調(diào)Bcl-2和p-Ak等通路蛋白的表達(dá)，并上調(diào)bax蛋白，進而活化Caspase-3凋亡因子，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞變性和凋亡。同時，IL-6還可以激活鈣通道造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，造成神經(jīng)細(xì)胞的變性凋亡[20]。

課題組前期的預(yù)實驗中對AST的給藥濃度做了綜合的研究，結(jié)果提示10-4mol/L的AST濃度過高，原代大腦皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)變性凋亡。10-8～10-5mol/L均未造成皮質(zhì)原代神經(jīng)元的變性凋亡，起到了較好的神經(jīng)元保護的作用。體外研究表明，AST能顯著提高Hb誘導(dǎo)損傷的原代大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞存活率。體內(nèi)實驗結(jié)果提示，給予AST連續(xù)灌胃治療小鼠ICH后，AST能明顯改善ICH小鼠的神經(jīng)功能缺損程度的評分，小鼠腦出血血腫周圍組織炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)也明顯低于模型組，提示AST通過抑制炎癥因子的表達(dá)改善ICH小鼠的血腫周圍炎癥反應(yīng)。另外，ICH小鼠血腫周圍組織Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)對照組，證實了Caspase-3在參與了ICH的神經(jīng)元變性凋亡的過程，而ICH小鼠在給予不同劑量的AST治療后，Caspase-3凋亡蛋白的表達(dá)顯著降低，提示AST對ICH的保護作用也可通過抗神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡作用有關(guān)。

綜上所述，本課題實驗結(jié)果與上述文獻(xiàn)報道相符，AST的作用機制可能與其保護受損神經(jīng)元，減輕小鼠腦出血的炎癥因子、凋亡因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，為AST臨床用于ICH的防治提供了基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。

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