姜 平，岳耀先，謝琰臣，高 翔，谷傳凱，郝洪軍，秦 月，丁曉君，宋 敏，張 栩，李海峰

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是T細胞依賴、自身抗體介導(dǎo)的自身免疫疾病[1]。白介素-4(interleukin-4，IL-4)是B細胞的生長分化因子，促進抗體產(chǎn)生和亞類轉(zhuǎn)化，還參與調(diào)節(jié)性T細胞功能。IL-4與三類IL-4受體(IL-4R)復(fù)合物結(jié)合以行使其功能：Ⅰ類IL-4R復(fù)合物表達于T淋巴細胞、NK細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞，Ⅱ類復(fù)合物表達于非淋巴細胞來源的腫瘤細胞，Ⅲ類復(fù)合物表達于B細胞和單核細胞[2]。α鏈是三類IL-4R復(fù)合物共有的關(guān)鍵亞單位，IL-4與IL-4R結(jié)合可以在上述不同細胞募集IL-4R另外兩條鏈中的一條形成異源二聚體啟動信號傳導(dǎo)。IL-4在MG的發(fā)病中起重要作用。MG患者的血清IL-4水平顯著低于健康人[3]。用乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)致敏敲除IL-4基因的小鼠一次即可導(dǎo)致長期的肌肉無力[4]。在實驗性變態(tài)反應(yīng)性MG模型，用AChR抗體與肌細胞共孵育后肌細胞的IL-4R水平上調(diào)并且對IL-4的反應(yīng)性增強，提示IL-4R在MG發(fā)病中的作用[5]。

迄今尚無IL-4基因多態(tài)性與MG相關(guān)的證據(jù)[6]。IL-4Rα的基因多態(tài)性與多種自身免疫疾病的易感性有關(guān)[7～11]。Pal等報道MG患者IL-4Rα的GG基因型頻率顯著高于健康對照[12]。IL-4R基因多態(tài)性與MG的關(guān)系尚需獨立驗證。本研究在中國人MG隊列探索IL-4R基因多態(tài)性與MG易感性和嚴重程度的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 納入青島大學(xué)附屬醫(yī)院和北京友誼醫(yī)院診治隨訪的480例MG患者，均符合MG的診斷標準：典型波動性肌肉無力癥狀且新斯的明試驗陽性，并且AChR抗體陽性和/或重復(fù)神經(jīng)刺激低頻遞減>10%。AChR抗體用ELISA試劑盒(RSR Limited，Cardiff，UK)檢測。隨機選取同一地區(qū)健康查體人員487例為對照組，已排除慢性感染和自身免疫疾病?；颊吆蛯φ站鶠闈h族人，患者間及患者和對照間均無親緣關(guān)系。本研究獲得各自醫(yī)院倫理委員會批準，患者本人或家長(<15歲的患者)及對照均簽署了知情同意書。納入的患者每年至少隨訪2次，且在病情加重及治療方案調(diào)整后的2～3 m內(nèi)隨訪。MG組按性別、發(fā)病年齡[13]、有無胸腺瘤、AChR抗體(陽性/陰性)、首發(fā)受累范圍(眼肌型/全身型)及發(fā)病后2 y間最嚴重時Oosterhuis 評分[14]分為相應(yīng)亞組。自然史研究[15]報道稱MG患者中有82%在發(fā)病2 y內(nèi)發(fā)展到疾病最嚴重程度，因此我們僅對病程在2 y以上且有充分資料的患者進行最嚴重時 Oosterhuis評分的分析。由于臨床特征間存在交互作用[16，17]，因此我們在亞組分析時還使用一個新的亞組分類方案(見圖1)[18]。

圖1 新分類的流程圖

1.2 SNP選擇和實驗方法 選擇IL-4R基因的6個位點，其中rs1805010、rs1805011、rs1805015和rs1801275是位于外顯子區(qū)的錯義突變，rs2107356位于基因 5’端上游區(qū)域，rs8832位于3’末端，最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)均>5%(1000 Genomes項目(http：//www.internationalgenome.org/)，東亞人群的MAF值)。取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血0.5 ml，使用Biochain試劑盒(Biochain，Newark，CA，USA)提取DNA。采用上海天昊生物科技有限公司專利SNPscanTM技術(shù)進行基因分型。隨機選取40例樣本進行雙盲質(zhì)控，質(zhì)控結(jié)果與原分型結(jié)果一致。

1.3 統(tǒng)計方法 采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗(SPSS軟件19.0版)比較MG組與對照組、各MG亞組與對照組以及MG亞組間等位基因的頻率。多重校正采用Bonferonni方法。使用在線軟件SNPstats(http：//bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)進行對照組Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，并在共顯性、加性遺傳模型下比較組間基因型頻率的差異。當MG亞組分析發(fā)現(xiàn)等位基因頻率有顯著性差異時，進行Logistic回歸分析其是否為獨立的相關(guān)因素。

2 結(jié) 果

2.1 MG組與對照組的一般情況 MG患者中男性189例，女性291例，發(fā)病年齡為1～86歲(中位數(shù)40歲，四分位間距32歲)。MG組患者的病程8～220 m(中位數(shù)43 m，四分位距61 m)，每年平均隨訪6.5次。健康對照共487例，其中男249例，女238例，年齡14～78歲(中位數(shù)45歲，四分位間距24歲)。6個SNP的分型成功率為97.93%～99.48%，對照組各SNP基因型的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。

2.2 MG組與對照組比較 MG組rs1801275 G等位基因的頻率顯著高于對照組(P=0.036，OR=1.293，95%CI1.017～1.643)，但未通過Bonferonni校正。MG組與對照組相比，rs1801275的基因型頻率在共顯性模型和加性模型下有顯著差異(見表1)。

表1 MG患者和健康對照中SNP的分布

a：MG與對照組相比，P=0.036，OR=1.293 (1.017-1.643)，PBon=0.216；共顯性模型，P=0.048；加性模型，P=0.015

2.3 MG亞組與對照組及亞組間的比較 伴胸腺瘤亞組rs2107356 T等位基因和rs1805010 A等位基因的頻率顯著高于對照組和不伴胸腺瘤亞組，通過Bonferonni校正；但這兩個SNP的等位基因頻率在不伴胸腺瘤亞組與對照組間無顯著性差異。伴胸腺瘤亞組與對照組或不伴胸腺瘤亞組相比，這兩個SNP的基因型頻率在共顯性和加性模型下有顯著性差異(見表2)。

AChR抗體陽性亞組rs1801275 G等位基因的頻率顯著高于對照組，通過Bonferonni校正。該等位基因的頻率在男性MG患者顯著高于男性對照(P=0.017，OR=1.531，95%CI1.086～2.160)，在AChR抗體陽性亞組顯著高于AChR抗體陰性亞組(P=0.039，OR=1.522，95%CI1.020～2.271)，但未通過Bonferonni校正。該等位基因的頻率在AChR抗體陰性亞組與對照組間無顯著性差異。AChR抗體陽性亞組與對照組相比，rs1801275的基因型頻率在共顯性和加性模型下有顯著性差異(見表2)。

2.4 對基于臨床特征的亞組分析中潛在混雜因素的校正 以胸腺瘤(伴/不伴)為因變量，以發(fā)病年齡(<15/15～50/>50歲，以為<15歲參考)、性別(男/女)、AChR抗體(+/-)、發(fā)病時的受累肌群(眼肌型/全身型)和基因型(共顯性和加性模型下)為自變量進行Logistic回歸，發(fā)現(xiàn)發(fā)病年齡、AChR抗體和rs2107356(P=0.011)及 rs1805010(P=0.001)的基因型是伴胸腺瘤的獨立相關(guān)因素。以AChR抗體(+/-)為因變量，以發(fā)病年齡、性別、胸腺瘤、發(fā)病時的受累肌群和基因型(共顯性和加性模型下)為自變量，Logistic回歸發(fā)現(xiàn)胸腺瘤、發(fā)病時受累肌群和rs1801275的基因型(P=0.022)是AChR抗體陽性的獨立相關(guān)因素。

2.5 新分類的亞組與對照組及亞組間的比較 新分類采用MG的主要臨床特征組合形成有生物學(xué)和臨床意義的亞組，該分類使每個信息完整的患者均被分到一個亞組且只被分到一個亞組。按照新分類，兒童型71例；409例成人患者中伴胸腺瘤的成人亞組104例；300例不伴胸腺瘤的成人患者中，AChR抗體陰性亞組84例；204例AChR抗體陽性不伴胸腺瘤的成人患者中，早發(fā)型亞組(EOMG，發(fā)病年齡15～50歲)126例，晚發(fā)型亞組(LOMG，>50歲)78例；眼肌型起病亞組135例，全身型起病亞組67例；部分患者因信息不全無法分類。

伴胸腺瘤的成人亞組rs2107356 T等位基因和rs1805010 A等位基因的頻率顯著高于對照組和不伴胸腺瘤的成人亞組，通過Bonferonni校正。這兩個SNP的等位基因頻率在不伴胸腺瘤的成人亞組與對照組間無顯著性差異。伴胸腺瘤的成人亞組與對照組和不伴胸腺瘤的成人亞組相比，這兩個SNP的基因型頻率在共顯性和加性模型下有顯著性差異(見表3)。

AChR抗體陽性不伴胸腺瘤的成人亞組rs1801275的G等位基因頻率顯著高于對照組，通過Bonferonni校正。AChR抗體陽性不伴胸腺瘤的成人亞組該等位基因的頻率高于AChR抗體陰性不伴胸腺瘤的成人亞組(P=0.023，OR=1.750，95%CI1.086～2.160)，但未通過Bonferonni校正。該等位基因的頻率在AChR抗體陰性不伴胸腺瘤的成人亞組與對照組間無顯著性差異。在AChR抗體陽性不伴胸腺瘤的成人患者中，EOMG、LOMG、眼肌型發(fā)病和全身型發(fā)病亞組該等位基因的頻率顯著高于對照組，但在EOMG與LOMG亞組間以及在眼肌型發(fā)病和全身型發(fā)病亞組間無顯著性差異。AChR抗體陽性不伴胸腺瘤的成人亞組與對照組相比，rs1801275基因型的頻率在共顯性和加性模型下有顯著性差異(見表3)。

表2 MG亞組和對照組rs1805010、rs1801275和rs2107356的等位基因和基因型頻率[例數(shù)(%)]

注：*表示每組中成功分型且有足夠臨床資料的患者數(shù)。a：伴胸腺瘤亞組與對照組比較，P=0.003，OR=1.572(1.160～2.132)，PBon=0.018；共顯性模型，P=0.017；加性模型，P=0.0055。b：伴胸腺瘤亞組與不伴胸腺瘤亞組比較，P=0.002，OR=1.627(1.188～2.229)，PBon=0.012；共顯性模型，P=0.0025；加性模型，P=0.0023。c：伴胸腺瘤亞組與對照組比較，P=0.002，OR=1.596(1.180～2.158)，PBon=0.012；共顯性模型，P=0.008；加性模型，P=0.003。d：伴胸腺瘤亞組與不伴胸腺瘤亞組比較，P=0.001，OR=1.687(1.236～2.302)，PBon=0.006；共顯性模型，P=0.004；加性模型，P=0.0012。e：AChR抗體陽性亞組與對照組比較，P=0.003，OR=1.482(1.146～1.915)，PBon=0.018；共顯性模型，P=0.0032；加性模型，P=0.0007

表2 MG亞組和對照組rs1805010、rs1801275和rs2107356的等位基因和基因型頻率 [例數(shù)(%)](續(xù))

表3 新分類中MG亞組和對照組rs1805010、rs1801275和rs2107356的等位基因和基因型頻率 [例數(shù)(%)]

注：*表示每組中成功分型且有足夠臨床資料的患者數(shù)。a：伴胸腺瘤的成人亞組與對照組比較，P=0.003，OR=1.600(1.176-2.177)，PBon=0.018；共顯性模型，P=0.0056；加性模型，P=0.0017。b：伴胸腺瘤的成人亞組與不伴胸腺瘤的成人亞組比較，P=0.003，OR=1.634(1.179-2.264)，PBon=0.018；共顯性模型，P=0.0025；加性模型，P=0.0032。c：伴胸腺瘤的成人亞組與對照組比較，P=0.003，OR=1.583(1.166-2.148)，PBon=0.018；共顯性模型，P=0.0034；加性模型，P=0.0013。d：伴胸腺瘤的成人亞組與不伴胸腺瘤的成人亞組比較，P=0.001，OR=1.731(1.255-2.388)，PBon=0.006；共顯性模型，P=0.0025；加性模型，P=0.0012。e：AChR抗體陽性不伴胸腺瘤的成人亞組與對照組比較，P=0.006，OR=1.509(1.121-2.030)，PBon=0.036；共顯性模型，P=0.011；加性模型，P=0.0026

3 討 論

本研究旨在采用候選SNP策略在一個代表性的MG隊列探索IL-4R基因多態(tài)性與MG的易感性和嚴重程度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rs2107356和rs1805010的等位基因頻率在胸腺瘤亞組高于對照組和不伴胸腺瘤亞組，rs1801275的等位基因頻率在AChR抗體陽性亞組高于對照組，但未發(fā)現(xiàn)不同嚴重程度亞組間有顯著性差異。以前研究的亞組分析[16，17]發(fā)現(xiàn)單一的MG臨床特征會受到其他臨床特征的交互作用影響，所以我們在亞組的等位基因頻率有顯著性差異時進行Logistic回歸以尋找與某一臨床特征相關(guān)的獨立相關(guān)因素，發(fā)現(xiàn)rs2107356和rs1805010的基因型與胸腺瘤相關(guān)以及rs1801275的基因型與AChR抗體陽性相關(guān)。我們進而在新分類中進行亞組分析，該分類方案反映了目前對MG發(fā)病機制的認識，并盡可能減少臨床特征間交互作用的影響，發(fā)現(xiàn)在成人MG患者中rs2107356和rs1805010與伴發(fā)胸腺瘤相關(guān)，rs1801275與AChR抗體陽性不伴胸腺瘤的成人MG相關(guān)。兩種分類方法得到相近的結(jié)果。

rs2107356和rs1805010的等位基因和基因型頻率在伴胸腺瘤的成人亞組高于對照組和不伴胸腺瘤的成人亞組，但不伴胸腺瘤的成人亞組和對照組之間無差異。胸腺瘤是源于胸腺上皮的腫瘤，MG患者可伴有胸腺瘤[19]。本研究首次發(fā)現(xiàn)這兩個SNP與胸腺瘤相關(guān)。IL-4是有促進腫瘤生長作用的細胞因子，以濃度依賴性方式促進人類腫瘤細胞的增殖。在體內(nèi)阻斷IL-4R可顯著減少一些腫瘤的淋巴結(jié)和血源性轉(zhuǎn)移。IL-4亦可通過增加抗凋亡分子的表達而促進腫瘤生存。IL-4對腫瘤的作用主要由II類IL-4R復(fù)合物途徑信號介導(dǎo)[2]。rs2107356也與胃癌[20]和多發(fā)性骨髓瘤[21]的易感性有相關(guān)性，rs1805010與腎細胞癌[22]及宮頸癌[23]的易感性有相關(guān)性，大多數(shù)腫瘤為上皮來源。IL-4R在胸腺瘤發(fā)病機制中的作用可能與在這些腫瘤中的機制相似。

MG患者rs1801275 G等位基因的頻率高于對照組，尤其是在AChR抗體陽性不伴胸腺瘤的成人亞組。rs1801275的基因型是MG患者AChR抗體陽性的獨立相關(guān)因素。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該突變是一種“獲得功能”的突變，可促進IL-4R的信號傳導(dǎo)，在免疫調(diào)節(jié)中的信號傳導(dǎo)能力高于野生型[24，25]。該變異型可以促進調(diào)節(jié)性T細胞在IL-4主導(dǎo)下向Th17轉(zhuǎn)化，影響哮喘嚴重程度[11]。但Pal等并未發(fā)現(xiàn)該變異型與MG相關(guān)[12]。

我們的研究有一定局限性：未納入僅有胸腺瘤而未發(fā)生MG的患者，未來需納入這些患者驗證IL-4R基因多態(tài)性與胸腺瘤的相關(guān)性。而且，既往研究發(fā)現(xiàn)伴胸腺瘤MG患者的T細胞受體與不伴胸腺瘤MG患者不同[26]。IL-4R多態(tài)性對在胸腺瘤生長和誘導(dǎo)T細胞表達特定T細胞受體的作用有待進一步研究。

總之，在中國漢族人群，rs2107356、rs1805010和rs1801275與MG的易感性相關(guān)。

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