吳 沙，呂 霞，何 林，張亦雯，張益梅，李經(jīng)倫

含碳物質(zhì)的不完全燃燒生成過量一氧化碳(Carbon monoxide，CO)，人體吸入過量CO后引起的中毒稱急性一氧化碳中毒(Acute carbon monoxide poisoning，ACOP)，是臨床工作中常見的急危重癥病，致死致殘率極高。在生活生產(chǎn)中，通氣不良的環(huán)境下以煤氣中毒、炭火燃燒、工業(yè)泄漏等形式威脅著人們的生活。急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(delayed encephalophathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP)即神經(jīng)精神后發(fā)癥，是指約10%～30%急性CO中毒患者早期即使經(jīng)成功救治意識障礙恢復(fù)后，仍表現(xiàn)出在一定時間的“偽恢復(fù)期”(2～60 d)后出現(xiàn)以精神心理行為異常、癡呆癥狀，以及錐體系、錐體外系癥狀為主的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征[1]。因其高致死率、高致殘率無疑已成為ACOP患者最為嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病幾率在重度CO中毒中可達10%～40%，預(yù)后不佳，給社會和家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟負擔(dān)，同時多年來該病的預(yù)防及治療也成為擺在國內(nèi)外無數(shù)臨床醫(yī)師面前的極大挑戰(zhàn)。目前對于該病發(fā)病機制的研究蕓蕓眾多，十分復(fù)雜，但仍無統(tǒng)一定論，且任意一種均不能齊全地解釋其具體發(fā)病特點。近幾年來核因子2-相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2/anti-oxidant response element，Nrf2/ARE)通路在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮著舉足輕重的作用，而ACOP中毒的本質(zhì)為缺氧引發(fā)的一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，近年來研究表明該通路在DEACMP發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，醌氧化還原酶1(NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1)作為其下游經(jīng)典靶基因之一，是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)物質(zhì)處于氧化還原狀態(tài)的黃素酶[2]，因其催化醌類物質(zhì)無單電子中間產(chǎn)物及自由基產(chǎn)生而發(fā)揮保護細胞作用已為人們所熟知，但隨著研究的深入其弊端也逐漸浮現(xiàn)。該研究通過在成功建立ACOP中毒后遲發(fā)性腦病(DEACMP)大鼠模型，運用Nrf2激動劑叔丁基對苯二酚(tertiary buty lhydroquinone，tBHQ)干預(yù)大鼠觀察其下游靶基因NQO1的表達進一步探討NQO1在該病發(fā)病中發(fā)揮的作用，為進一步研究DEACMP 發(fā)病機制提供實驗參考，致力于減少臨床上DEACMP 的發(fā)生，為探究其靶向治療奠定基石、提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要的實驗材料

1.1.1 實驗動物 在成都達碩實驗動物有限公司購買健康的清潔級SD雄性大鼠180只，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)城北動物實驗中心，體重約300 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2016～15。在溫度20～25 ℃、濕度約40%～70%、光暗12 h交替環(huán)境、給予充足的鼠糧及高壓消毒純凈水飼養(yǎng)；

1.1.2 主要實驗試劑 在瀘州市西南化工研究院購買CO純品氣體(中國)，南京華立明化工購買tBHQ試劑(中國)，圣克魯斯生物技術(shù)公司的兔抗鼠NQO1多克隆抗體(中國)，Roche公司的Western熒光試劑、Tunel試劑盒(德國)，Dako公司Envision試劑盒(丹麥)。

1.1.3 主要實驗儀器 購自中國成都泰盟軟件有限公司的Morris水迷宮實驗儀、美國雅培公司的血氣分析儀、英國BRIGHT公司的石蠟切片機、美國徠博公司的倒置顯微鏡、美國ProteinSimple公司的凝膠成像儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 模型建立、干預(yù)處理：將飼養(yǎng)并訓(xùn)練1 w的雄性SD大鼠進行Morris水迷宮實驗，去掉有學(xué)習(xí)記憶功能缺失的大鼠，從180只可取的大鼠中隨機抽出60只作為空氣對照組(AC組)，剩余大鼠用于建立遲發(fā)性腦病模型，按染毒后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d分為6個亞組，染毒方式如下[3]：首劑CO以100 ml/kg體重腹腔注射，每隔4 h以50 ml/kg體重劑量追加注射，連續(xù)追加3次。AC組予以同等方式注射空氣。腹腔注射CO的大鼠隨機分成TC組60只、CO組60只，按50 mg/kg體重每日一次相同時間點腹腔注射tBHQ溶劑于TC組大鼠，CO組大鼠不做其他處理。

1.2.2 模型判定 動脈血碳氧血紅蛋白(HbCO)濃度測定：從TC、CO組每個亞組中隨機抽取1只大鼠，AC組中隨機抽取1只，按染毒前及注射首劑CO后的不同時間點(15 min，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，14 h，16 h，20 h)采集0.5 ml股動脈血，血氣分析儀測HbCO濃度。采用Morris水迷宮實驗方法驗證大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。

1.2.3 取材、標(biāo)本處理 從各組中按每個時間點隨機選出一部分大鼠，適量生理鹽水進行左心室心臟灌洗，4%多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦，4%多聚甲醛中保存，48 h內(nèi)冠狀位切取含海馬、齒狀回的腦組織進行石蠟包埋、切片。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測NQO1的表達 烤片脫蠟、梯度酒精水化，PBS沖洗，內(nèi)源性過氧化物酶失活，枸櫞酸納緩沖液抗原修復(fù)，加一抗室溫1 h，4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫45 min，PBS沖洗后加二抗，辣根過氧化物酶酶標(biāo)，DAB顯色3～10 min，顯微鏡下調(diào)控染色水平，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片，鏡下觀察，采用人工半定量計數(shù)法對陽性表達細胞進行統(tǒng)計分析[4]。

1.2.5 Western Blot檢測NQO1 蛋白 提取蛋白，配膠，加樣，變性離心，放入4 ℃冰箱備用，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后進行免疫反應(yīng)、顯色，經(jīng)凝膠成像儀成像，以B-actin為參考值，得出NQO1條帶密度相對值，與內(nèi)參值比較得出目標(biāo)條帶灰度值，進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 TUNEL染色 梯度酒精脫蠟，滴加試劑酶標(biāo)、DAB 顯色，復(fù)染后脫水透明、封片，40×10倍光鏡下觀察海馬CA1區(qū)細胞凋亡情況，算出凋亡指數(shù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 染毒后行為學(xué)表現(xiàn) 與AC組比較，TC組、CO組大鼠染毒后不久(<10 min)即有躁動不安、過度呼吸表現(xiàn)，CO追加次數(shù)增多后發(fā)生精神萎靡、四肢乏力、呼吸困難、末梢循環(huán)缺氧表現(xiàn)，部分大鼠甚至發(fā)生肢體強直抽搐、大小便失禁、喪失意識、死亡(8只)。保持通風(fēng)良好的空氣環(huán)境中完成操作，及時補充相應(yīng)數(shù)目大鼠的同時將死亡的大鼠剖腹解剖，其內(nèi)臟不同程度腫脹、顏色暗紅、表面散在出血點，剝開顱骨發(fā)現(xiàn)其腦組織彌漫性充血水腫。其余存活大鼠攝食減少、精神萎靡、易受驚嚇。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示中毒大鼠隨染毒時間延長其活動路徑以隨機、自由、散漫形式多見，毫無規(guī)律。染毒后14 d始平均潛伏期較AC組明顯延長、平臺象限活動時間、穿越平臺頻次明顯減低(P<0.05)，直至28 d，TC組上述變化明顯較CO組顯著(P<0.05)。

2.2 動脈血HbCO濃度變化 染毒前各組大鼠動脈血HbCO濃度均<1%，首劑注射CO 15 min后，HbCO濃度攀升達65%左右，2 h時仍高于60%，4 h時降至55%左右，此時進行追加半劑CO后測HbCO濃度繼續(xù)攀升至70%左右，而后下降走勢，整個染毒過程大鼠體內(nèi)HbCO濃度>50%持續(xù)超過16 h。

2.3 海馬區(qū)NQO1的表達

2.3.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果 AC組大鼠海馬CA1區(qū)NQO1蛋白表達極少，各時間點無明顯差異。TC組、CO組大鼠海馬CA1區(qū)NQO1蛋白的陽性細胞在40×10倍顯微鏡下胞核和胞質(zhì)出現(xiàn)深淺不一的棕褐色或棕黃色，呈上升-峰點(3 d)-下降的走勢，TC組峰點較CO組峰點更高更明顯，TC組、CO組組內(nèi)染毒后3 d與其他時間點比較及各組間各相同時間點比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1，見表1)。

圖1 A、B、C分別為染毒后3 d，AC組、CO組、TC組大鼠海馬CA1區(qū)NQO1蛋白表達情況，陽性細胞為棕褐色或棕黃色

表1 3組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點NQO1免疫組化陽性結(jié)果比較分)

注：與AC組比較各相同時間點*P<0.05；與CO組比較△P<0.05；組內(nèi)：TC組內(nèi)▽P<0.05；CO組內(nèi)▲P<0.05

2.3.2 Western Blot結(jié)果 AC組大鼠海馬NQO1蛋白表達不顯著，CO組、TC組大鼠海馬中NQO1的表達(見圖2)。

2.4 Tunel染色 AC組大鼠凋亡細胞少，各時間點無明顯變化。TC組、CO組大鼠染毒后均出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡現(xiàn)象，從1 d開始逐步攀升，7 d達峰點，而后逐漸下降，且組內(nèi)峰期凋亡情況與其他時間點比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。達峰點(7 d)前TC組較CO組細胞凋亡指數(shù)下降，達峰點之后TC組較CO組細胞凋亡指數(shù)升高，除14 d外其他各時間點組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3，表2)。

圖2 Western Blot結(jié)果顯示NQO1的表達條帶

圖3 A、B、C分別為染毒后7 d的AC組、CO組、TC組大鼠海馬CA1區(qū)細胞凋亡情況，胞內(nèi)含棕色顆粒的細胞為凋亡細胞

表2 3組大鼠海馬CA1區(qū)不同時間點細胞凋亡指數(shù)的比較

注：與AC組比較各相同時間點*P<0.05；與CO組比較△P<0.05；TC組內(nèi)▽P<0.05，CO組內(nèi)▲P<0.05

3 討 論

NQO1(醌氧化還原酶1、DT-diaphorase)是真核生物細胞內(nèi)廣泛存在的一種可誘導(dǎo)的黃素蛋白酶，最早由Ernster 和Navazio于1958年報道[5]。胞質(zhì)中多見，由NADH或NADPH提供電子催化醌類及其衍生物發(fā)生雙電子還原反應(yīng)，催化反應(yīng)過程中無單電子還原產(chǎn)物或自由基生成故能保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷[6]，可被缺氧環(huán)境、抗氧化劑、多環(huán)芳烴、偶氮染料等誘導(dǎo)表達，這種可誘導(dǎo)性使得NQO1在腫瘤預(yù)防及治療上發(fā)揮舉足輕重的作用，缺氧和高氧化應(yīng)激是腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志性特征之一，研究發(fā)現(xiàn)NQO1在消化、呼吸、生殖、皮膚系統(tǒng)等多種腫瘤性疾病中高表達提示預(yù)后不良，患者生存率降低[7，8]。DEACMP實質(zhì)是缺氧誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)后導(dǎo)致的一系列腦功能障礙疾病，抗氧化劑還可通過生物異源性物質(zhì)反應(yīng)元件(XRE)激活 NQO1基因的表達，NQO1主要存在于細胞質(zhì)中，以NADH或NADPH作為電子供體，催化包括醌、醌亞胺、亞甲藍、二氯靛酚、谷胱甘肽取代的蔡醌、偶氮和硝基化合物等等在內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生還原反應(yīng)，不生成親電子還原產(chǎn)物及自由基，可解毒醌為毒性較低的氫醌類化合物而清除，避免對細胞的損傷，是公認的解毒防癌酶[9]。NQO1參與維生素E介導(dǎo)的抗氧化，充當(dāng)輔酶Q的還原酶，維持P53蛋白穩(wěn)定從而起到保護神經(jīng)元細胞免受氧化應(yīng)激以及一系列其他內(nèi)源性毒素損傷的效果[10]；在慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病如：帕金森病和肌萎縮側(cè)索硬化中誘導(dǎo)NQO1的表達上調(diào)能夠起到很好的神經(jīng)保護作用[11]，阿爾茨海默病(AD)患者腦組織中大量神經(jīng)細胞丟失、凋亡，神經(jīng)細胞外老年斑沉積，神經(jīng)纖維纏結(jié)，其中就富含NQO1[12]。且有動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)[13]NQO1基因敲除小鼠腦出血發(fā)生率及神經(jīng)細胞損傷嚴(yán)重程度顯著高于野生型小鼠。

而近年來有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NQO1還原而生成的產(chǎn)物因其結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性差異而可能對細胞產(chǎn)生相應(yīng)的毒副作用[14]。經(jīng)NQO1催化生成的產(chǎn)物氫醌對細胞凋亡影響存在量效、時效關(guān)系，當(dāng)氫醌在細胞內(nèi)達一定濃度或持續(xù)作用一定時間后不僅誘導(dǎo)細胞凋亡還引起細胞繼發(fā)性壞死[15]。其機制可能如下：(1)低劑量氫醌可能誘導(dǎo)HSP、peroxiredoxin等保護性蛋白表達以使細胞發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)保護細胞，但細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)激烈時，cys發(fā)生不可逆的活化，上述保護性蛋白發(fā)生過氧化而失活，細胞內(nèi)氧化還原失衡最終致細胞死亡[16]。(2)氫醌通過激活內(nèi)源性細胞凋亡途徑，促發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，尤其是Caspase-3、Caspase-7活化，誘導(dǎo)細胞程序化死亡[17，18]。(3)氫醌可激活蛋白激酶B，使其定位于胞質(zhì)中調(diào)控下游信號分子FasL、P27、cyclinE、cyclinB等表達影響細胞周期及發(fā)生凋亡作用[19，20]。(4)氫醌可經(jīng)多途徑代謝，代謝過程可產(chǎn)生活性氧(ROS)，ROS通過直接參與細胞信號通路，使線粒體膜電位變化促發(fā)線粒體細胞凋亡程序[21]。(5)氫醌可激活DNA-PKcs/Akt信號通路，活化Akt(蛋白激酶B)進一步推動氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激正反饋促進Akt活化，增強細胞對ROS誘發(fā)細胞凋亡的作用[22]。

tBHQ為廣泛應(yīng)用于人們生活生產(chǎn)中的抗氧化劑，同時是受Nrf2/ARE調(diào)節(jié)的二相解毒酶誘導(dǎo)劑，能調(diào)節(jié)該通路下游靶基因NQO1、HO-1、GSH等的表達[23]，有實驗發(fā)現(xiàn)20 μmol/LtBHQ處理細胞，胞核中Nrf2在加藥后8 h表達最佳，其下游靶蛋白NQO1在胞質(zhì)中加藥后16 h表達最佳，撤去tBHQ后其誘導(dǎo)表達持續(xù)4 h[24]。故本實驗采用染毒后每日一次相同時間點腹腔注射經(jīng)乙醇溶解的濃度為5 mg/mL的tBHQ，達到其持續(xù)誘導(dǎo)NQO1表達的效果。另外本實驗采用成熟的改良式腹腔注射CO法建立ACOP中毒遲發(fā)性腦病大鼠模型，使大鼠體內(nèi)動脈血HbCO濃度>50%至少持續(xù)達16 h之久，能達到類似臨床中重度CO中毒患者的程度，更利于DEACMP發(fā)病[25]。

Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)TC、CO組大鼠在染毒后前7 d并未出現(xiàn)智能障礙，這與臨床DEACMP患者發(fā)病經(jīng)歷潛伏期相似。Tunel染色發(fā)現(xiàn)TC組大鼠出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡，染毒后前7 d凋亡指數(shù)逐步攀升，7 d達高峰期，TC組與CO組、AC組相同時間點比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，CO組大鼠細胞凋亡也為類似走勢但TC組凋亡指數(shù)均低于CO組，且高于AC組。免疫組化結(jié)果顯示染毒后大鼠海馬區(qū)NQO1的表達從1 d開始逐漸增加，3 d達峰點，且TC組與CO組、AC組每個相同時間點比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，TC組大鼠海馬CA1區(qū)NQO1的表達明顯高于CO組、AC組。我們有理由相信在大鼠急性一氧化碳中毒后體內(nèi)發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，染毒前期(染毒后3 d)通過每日一次不間斷運用Nrf2激動劑tBHQ，NQO1一定程度高表達的同時細胞凋亡指數(shù)有所下降，通過穩(wěn)定某些保護性蛋白活性、減少自由基生成、減少蛋白酶體降解等作用發(fā)揮正性防御作用從而阻止大鼠高級神經(jīng)功能損傷。

而Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)14 d開始TC、CO組大鼠穿越平臺頻次減少，活動路徑隨機自由散漫，日趨嚴(yán)重，提示大鼠發(fā)生了進行性的學(xué)習(xí)記憶能力障礙。而此時TUNEL染色發(fā)現(xiàn)7～28 d兩組大鼠均發(fā)生明顯細胞凋亡現(xiàn)象，免疫組化結(jié)果顯示染毒3 d后NQO1持續(xù)高表達、緩慢下降走勢，且TC組與CO組、AC組每個相同時間點比較均明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時TUNEL染色結(jié)果顯示此時段TC組細胞凋亡指數(shù)逐漸較CO組升高，直至28 d水迷宮實驗結(jié)果顯示TC組高級神經(jīng)功能損傷重于CO組，提示在染毒后期盡管細胞內(nèi)NQO1表達增高發(fā)揮了足夠保護作用但仍不能阻止其毒性作用持續(xù)、細胞凋亡進展直至凋亡高峰出現(xiàn)，腦細胞因凋亡大量丟失致神經(jīng)功能缺損，TC組中NQO1持續(xù)高表達不但不能發(fā)揮正性保護作用反而進一步加重細胞凋亡，高級神經(jīng)活動發(fā)生進行性損害。這與Lee等發(fā)現(xiàn)細胞在缺血缺氧環(huán)境下，NQO1蛋白的持續(xù)過表達抑制細胞存活甚至促進細胞凋亡的觀點不謀而合，其機制可能是持續(xù)過表達的NQO1激活A(yù)MPK通路，而后遏制mTOR信號通路有關(guān)[26]。因免疫組化僅對海馬CA1區(qū)NQO1表達進行了統(tǒng)計，為增加結(jié)果的準(zhǔn)確性我們對整個海馬的NQO1表達進行Western Blot法檢測，得出的結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。TC、CO組凋亡高峰出現(xiàn)時間推后于NQO1蛋白表達峰點，或許與細胞功能變化到細胞器實質(zhì)發(fā)生變化所需時間有關(guān)，而其行為學(xué)的改變基本與明顯細胞凋亡發(fā)生時間平行，進一步說明在DEACMP發(fā)病機制中海馬區(qū)細胞發(fā)生的遲發(fā)性凋亡起著舉足輕重的作用。

大鼠急性CO中毒后，對缺氧反應(yīng)靈敏的海馬區(qū)細胞受到氧化應(yīng)激作用，前期NQO1表達升高通過穩(wěn)定保護性蛋白活性、減少自由基生成等途徑防御腦細胞損傷，但后期NQO1持續(xù)高表達導(dǎo)致其氧化還原產(chǎn)物氫醌生成達一定濃度、堆積達一定時間誘導(dǎo)凋亡途徑的發(fā)生，且細胞持續(xù)缺氧難以抵抗鈣離子集聚、炎癥介質(zhì)釋放等的發(fā)生，甚至推動細胞遲發(fā)性凋亡的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)Pearson 直線相關(guān)分析顯示CO及TC組NQO1表達與凋亡指數(shù)趨勢一致，CO組NQO1與細胞凋亡呈正相關(guān)(r=0.505，P<0.001)，TC組NQO1與細胞凋亡無相關(guān)性(r=0.0049，P<0.001)，實質(zhì)上TC組中兩者并不是沒有相關(guān)性，而是NQO1升高與細胞發(fā)生凋亡之間密切程度不高，即NQO1高表達在染毒后前期發(fā)揮抗凋亡作用和后期發(fā)揮促凋亡作用更顯著，將兩時段結(jié)合分析得出相關(guān)性不高的結(jié)果。

近年來臨床中仍有大量急性CO中毒所致精神心理行為異常、智能減退、運動障礙、甚至癱瘓癡呆、尿便失禁、生活不能自理的患者，嚴(yán)重影響患者及家人的生活質(zhì)量，DEACMP致病病理生理途徑多樣且繁雜，是臨床工作者持續(xù)面臨的挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)Nrf2/ARE通路在其中起著至關(guān)重要的作用，其下游抗氧化蛋白NQO1在一定時間內(nèi)一定程度的發(fā)揮著正性積極作用，而隨著NQO1持續(xù)高表達后對細胞的消極負性作用逐漸浮出水面。本實驗為進一步研究其致病機制及靶向治療提供了實驗基礎(chǔ)，為臨床減少DEACMP的發(fā)生和研究其靶向治療提供一定的基礎(chǔ)和方向。

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