曹江平，邸宏偉，梁永鋒，羅菊花，解啟龍

(1.寧夏師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，寧夏固原756000；2.寧夏師范學(xué)院六盤山資源工程技術(shù)研究中心，寧夏固原756000；3.中國(guó)科學(xué)院山西煤炭化學(xué)研究所煤轉(zhuǎn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030001)

0 引言

維生素A（VA）是維持人體正常代謝功能所必需的脂溶性維生素之一，有維持視力、促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)、細(xì)胞分化和抗氧化并增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力的功能[1-3]。一般需從食物中攝取，肝臟、蛋類和乳品等動(dòng)物源食品含有豐富的VA，是人體所需VA的重要來源[4-5]。嬰幼兒配方乳粉中VA的含量是乳粉重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)之一，我國(guó)因此制定了測(cè)定其含量的國(guó)標(biāo)方法[6]。目前，測(cè)定VA的方法主要有電化學(xué)法[7]、高效液相色譜法[8-12]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]和同位素稀釋法[14-16]。

分散液液微萃取技術(shù)是一種環(huán)保型低溶劑萃取法[17-18]，因其諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來已廣泛應(yīng)用于食品及環(huán)境分析中[19-22]。但在配方奶粉中VA的分離分析尚未見報(bào)道，本文建立了基于離子液體的分散液液微萃取技術(shù)對(duì)配方奶粉中VA萃取，并結(jié)合高效液相色譜紫外檢測(cè)技術(shù)測(cè)定其含量，并將此法成功應(yīng)用于市售配方奶粉中VA的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

3種配方奶粉樣品購自當(dāng)?shù)爻?；VA標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào):68-26-8，純度95%，上海晶純生化科技股份有限公司）；[C4M IM][PF6]、[C6M IM][PF6]、[C8M IM][PF6]離子液體（純度99.0%，上海成捷化學(xué)有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，抗壞血酸、乙醇、氯化鈉、氫氧化鉀、硫酸鈉、鹽酸均為市售分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；TA2204B型分析天平（上海精科天美科學(xué)有限公司）；PHS-3C型數(shù)字酸度計(jì)（江蘇江分電分析儀器有限公司）；TDL-80-2B型離心機(jī)（上海市安亭科學(xué)儀器廠）；SENCO-R系列恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）；KQ-5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPDR-II-20L超純組合高純水制取系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取恒重的VA標(biāo)準(zhǔn)品5.0 m g，用甲醇溶解，定容至5 m L的容量瓶中，得1.0 m g/m L的VA儲(chǔ)備液，4°C下保存；分別移取儲(chǔ)備液50.0、100.0、150.0、200.0、250.0μL，分別用甲醇稀釋并定容至5 m L容量瓶中，得濃度依次為 10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg/m L的VA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.1.2 KOH溶液的配制

準(zhǔn)確稱取恒重的KOH固體100 g，加入二次蒸餾水溶解并定容于100 m L容量瓶中，配成1 g/m L KOH溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.1.3 工作液的配制

取50.0μg/m L標(biāo)準(zhǔn)溶液1m L用甲醇稀釋并定容至50m L容量瓶，配成1.0μg/m L工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品制備與分析

1.3.2.1皂化

準(zhǔn)確稱取配方奶粉5.0 g于250 m L的圓底燒瓶中，加入15.0 m L溫度為40～50℃蒸餾水充分溶解。加入50.0 m L的無水乙醇，攪拌至顆粒分散均勻，依次加入1.0 g抗壞血酸，混勻，加入25.0 m L KOH溶液（1 g/m L）混勻，在恒溫磁力攪拌器上控制水溫53℃±2℃時(shí)，磁力攪拌皂化約45m in后，取出立刻冷卻至室溫，用二次蒸餾水洗滌燒瓶后合并洗滌液，離心取上清液并定容至100 m L，即得皂化液。

1.3.2.2 DLLM E

移取4.0m L皂化液于10 m L帶旋帽的錐形離心管中，加入5.0 m L的二次蒸餾水稀釋后，加入溶有等體積乙腈稀釋的100μL[C8M IM][PF6]（萃取劑），輕搖5 m in并3 500 r/m in離心3 m in，離心后萃取劑形成微小的液滴并沉積于離心管底部，棄去上清液，加入100μL乙腈稀釋后，用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確吸取沉積在錐形管底部的微小液滴計(jì)量體積，供HPLC分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：V甲醇∶V水=100∶0；流速1.00 m L/m in；進(jìn)樣量20μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，柱溫為室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 DLLM E條件優(yōu)化

取1.3.1.3配置的1.0μg/m L工作液進(jìn)行DLLM E操作，改變萃取條件，將所得樣品上機(jī)測(cè)試，對(duì)比各平行條件下萃取液分析所得萃取回收率優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。其中，回收率按公式（1）計(jì)算。

式中：C s是萃取完成后離子液體中VA濃度（μg/m L），VS是萃取完成后離子液體體積（m L）；Cw是萃取前樣品溶液中VA濃度（μg/m L），Vw是萃取前樣品溶液的液體體積（m L）。

2.1.1 萃取劑種類和用量的選擇

移取3.0 m L工作液于10 m L帶旋帽的錐形離心管中，加入6.0 m L的二次蒸餾水稀釋后，分別加入溶有100μL 3種離子液體萃取劑的100μL乙腈，對(duì)比萃取結(jié)果，如圖1（a）所示，[C8M IM][PF6]的萃取效果明顯好于[C4M IM][PF6]和[C6M IM][PF6]，因此選擇[C8M IM][PF6]作為樣品DLLM E的萃取劑。

萃取劑用量也影響實(shí)驗(yàn)效果，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了50～150μL不同萃取劑用量對(duì)萃取率的影響。結(jié)果如圖1（b）所示，萃取劑加入量從50μL增加到100μL時(shí)，萃取率呈增加的趨勢(shì)，100～150μL萃取率不再增加甚至降低，這可能是由于離子液體在水中的溶解作用導(dǎo)致?？梢?，加入100μL萃取劑的萃取效果達(dá)到最佳，因此，選擇萃取劑的用量為100μL。

圖1 萃取劑種類（a）和用量（b）的選擇

2.1.2 分散劑的選擇

分散劑用量也影響萃取率，皂化液中含有乙醇可作為分散劑，實(shí)驗(yàn)分別考查了移取2.0～9.0m L工作液加入二次蒸餾水稀釋到9.0 m L進(jìn)行萃取。結(jié)果顯示移取4.0 m L工作液加入5.0 m L蒸餾水稀釋后做DLLM E效果最好，因此在DLLM E過程樣品用量為移取4.0 m L樣品液加入5.0 m L蒸餾水稀釋。離子液體黏度大不便操作，需加入有機(jī)溶劑溶解稀釋后使用，實(shí)驗(yàn)對(duì)比了分別加入等體積乙醇、乙腈、四氫呋喃和丙酮對(duì)[C8M IM][PF6]的溶解效果，結(jié)果顯示乙腈效果最好，故實(shí)驗(yàn)選擇加入萃取劑等體積的乙腈稀釋離子液體，同時(shí)也做分散劑。

圖2 分散劑用量的選擇

2.1.3 pH值的選擇

適當(dāng)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值，可以改變?nèi)芤旱乃釅A度，改變分析物的存在狀態(tài)，從而影響萃取效率。VA為弱酸性物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)調(diào)節(jié)樣品液至pH=3，pH=5，pH=7，pH=11比較對(duì)萃取效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，樣品液pH=3時(shí)，萃取效果達(dá)到最佳。因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)將皂化液的pH調(diào)至3。

圖3 溶液pH的影響

2.1.4 離子強(qiáng)度的比較

改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度，會(huì)引起目標(biāo)分析物在樣品溶液中溶解度的改變。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不加N aC l和分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，10%，20%，30%氯化鈉對(duì)比其對(duì)萃取率的影響。結(jié)果如圖4，不加NaC l時(shí)萃取率最高，隨著N aC l加入量的增加，萃取率逐漸降低，因此本實(shí)驗(yàn)選擇不加N aC l。

圖4 離子強(qiáng)度的影響

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性、精密度和重現(xiàn)性

在優(yōu)化的條件下，做了方法學(xué)實(shí)驗(yàn)，VA濃度在1.0～100.0μg/L線性良好，工作曲線的回歸方程為Y=96.769x-6.7234(r2=0.9978)。為了驗(yàn)證方法的重現(xiàn)性，取實(shí)際樣品分別做了日內(nèi)和日間重現(xiàn)性，其精密度RSD分別為日內(nèi)1.92%，日間5.35%。

2.2.2 加標(biāo)回收率、檢出限和定量限

3種配方奶粉樣品做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1和圖5，加標(biāo)濃度5μg/g和10μg/g，加標(biāo)回收率為83.6～106.1%，RSD在1.86%～6.94%之間。方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以S/N=3和S/N=10計(jì)，分別為2.2μg/L和7.3μg/L。

2.3 實(shí)際樣品分析

為檢驗(yàn)方法在實(shí)際樣品中的適用性，運(yùn)用該法在優(yōu)化條件下對(duì)3種配方奶粉樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表1和圖5，3種配方奶粉樣品中VA含量分別為6.36μg/g、9.20μg/g、7.82μg/g，從回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，此方法能準(zhǔn)確測(cè)定配方奶粉中VA含量。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品色譜圖

3 結(jié)論

本文建立了基于離子液體的分散液液微萃取法提取配方奶粉中的VA，并結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定其含量，結(jié)果顯示該方法測(cè)定配方奶粉中VA可取得滿意結(jié)果。并將該方法成功運(yùn)用于測(cè)定3種配方奶粉樣品中VA的含量，所測(cè)枸杞樣品中VA含量為6.36～9.20 μg/g。該法有機(jī)溶劑用量少，操作簡(jiǎn)單快捷，線性良好，回收率高，實(shí)際樣品適用性強(qiáng)，可以為配方奶粉中VA的測(cè)定提供一定的技術(shù)參考。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果、加標(biāo)回收率

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