柴艷兵，李興佳，張耀廣，李飛，屈雅莉，楊春杰

(君樂寶乳業(yè)集團質量管理中心石家莊050021)

0 引言

乳品中污染的微生物主要有霉菌、酵母菌和細菌。酸奶中較低的pH值能夠抑制細菌的生長，但也為酵母菌的生長提供了有利的條件，因此，酵母菌的污染成為引起酸奶變質的主要菌群[1]。已有多名學者對酸奶中污染微生物進行研究，表明酵母菌能夠很大程度上引起酸奶的脹包[2-5]。酵母菌的污染主要來源于車間的生產環(huán)境，但酵母菌在車間的具體分布情況，及產品中污染酵母菌的溯源，卻研究甚少。

26S rDNA D 1/D 2區(qū)域序列高度變異性的特點，使其成為有效的酵母菌種級水平鑒定方法[6-7]，許多學者利用26S rDNA D 1/D 2區(qū)域對食品中的酵母菌進行鑒定，從而確定優(yōu)勢菌群[8-11]。本文以酸奶生產車間和30℃保溫庫中的脹包酸奶為研究對象，通過利用空氣沉降法、表面涂抹法和劃線分離法，利用26S rDNA D 1/D 2基因序列，對分離出的酵母菌進行分類鑒定，確定車間環(huán)境中酵母菌的分布及脹包產品中酵母菌的種類，通過溯源研究，為車間消毒殺菌的關鍵控制點提供理論依據(jù)，為產品中酵母菌污染的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

孟加拉紅培養(yǎng)基，麥芽浸粉肉湯，TIANam p Yeast DNA Kit酵母基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），Taq PCR M asterm ix，DNA M arkerⅢ，瓊脂糖凝膠，無水乙醇，溶菌酶，引物N L1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，N L4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

生化培養(yǎng)箱，電泳儀，PCR儀，壓力蒸汽滅菌器，恒溫水浴鍋，超凈工作臺，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 酸奶生產中酵母菌的分布研究

1.2.1.1 采樣時間：灌裝區(qū)每天進行一次監(jiān)測，其他區(qū)

域每周進行一次監(jiān)測，監(jiān)測周期為12個月。

1.2.1.2 采樣地點及方法

(1)采樣地點：配料區(qū)、熱處理間、巴殺區(qū)、接種區(qū)、發(fā)酵區(qū)、待裝區(qū)、灌裝區(qū)。

采樣方法：采用自然沉降法，將孟加拉紅瓊脂平板放置距離地面1m左右的監(jiān)測點，暴露15m in后合上蓋子，將平板倒置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。

(2)設備管路及表面：待裝罐內壁、巴殺殺菌機出口管路內壁、灌裝機成型器、灌注頭、膜軸。人員手部：測酸人員、灌裝機手、配料人員。

采樣方法：將滅菌的涂抹棒用滅菌的生理鹽水潤濕，在被涂抹物表面迅速擦拭100 cm2，立即均勻的涂抹在孟加拉紅瓊脂平板上，將平板倒置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。

1.2.1.3 菌株的分離鑒定

收集所有的平板，挑取平板上不同形態(tài)的細菌菌落，接種于麥芽浸粉肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，根據(jù)酵母菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA的提取。

PCR反應體系為：Taq PCR M asterm ix 25μL，正向引物N L1 1μL，反向引物N L4 1μL，DNA模板1μL，ddH2O 19μL。

PCR反應條件為：預變性94℃5 m in；30個循環(huán)，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s；72℃延伸10 m in；4℃保溫。擴增完畢后，取5μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇600 bp左右可見清晰條帶的擴增產物測序。

將測序序列在NCBI上Blast比對，獲取與所測序列相似度高的序列，確定菌株的分類地位。

1.2.2 產品中酵母菌的污染研究

收集30℃保溫庫中脹包的酸奶，從脹包中挑取一環(huán)劃線接種于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，將平板倒置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，按照1.2.1.3步驟進行菌株的鑒定。

2 結果與分析

2.1 酸奶生產中酵母菌的分布

通過空氣沉降和設備涂抹法對酸奶生產中分離的酵母菌落進行菌株鑒定，得到系統(tǒng)分類地位。由表1可以看出，空氣環(huán)境中共分離出132株酵母菌，共7個屬，分別為假絲酵母屬(Candida spp.)、棒孢酵母屬(C lavispora spp.)、紅酵母屬(Rhodotorula spp.)、囊酵母屬(Zygoascus spp.)、絲孢酵母屬(Trichosporon spp.)、鐵艾酵母屬(Tilletiopsis spp.)、隱球酵母屬(C ryptococcus spp.)。在設備表面及人員手部涂抹中，僅在灌裝機分離到一株酵母菌，為紅酵母屬(Rhodotorula spp.)，結果表明，酵母菌在設備表面上存在較少，大部分都存在在空氣中。因此，空氣的清潔度決定了酵母菌在車間的污染程度。

2.2 生產環(huán)境中不同酵母菌的污染比例

由圖1可知，在酸奶生產環(huán)境中，不同酵母菌的存在比例依次為：熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)（21.05%）、阿氏絲孢酵母(T richosporon asahii)（16.54%）、中間假絲酵母(Candida intermedia)（12.03%）、產朊假絲酵母(Candida utilis)（8.27%）、葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)（8.27%）、擬平滑念珠菌(Candida orthopsilo-sis)（7.52%）、C ryptococcus friedmannii（7.52%）、Tilletiopsis albescens（6.77%）、C ryptococcus saitoi（3.76%）、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)（3.01%）、大隱球酵母(C ryptococcus magnus)（2.26%）、小紅酵母(Rhodotorula minuta)（1.50%）、Zygoascusmeyerae（0.75%）、T richosporon coremiiforme（0.75%）。假絲酵母屬(Candida spp.)占總數(shù)的48.87%，為空氣中酵母菌的優(yōu)勢菌群。

2.3 產品中酵母菌的污染研究

通過對32個脹包產品中污染的酵母菌進行鑒定（表2），結果表明，引起產品脹包的酵母菌種類穩(wěn)定，主要為假絲酵母屬(Candida spp.)、棒孢酵母屬(C lavispora spp.)和W ickerhamomyces spp.。共分離得到5種酵母菌，分別為中間假絲酵母(Candida intermedia)、葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)、產朊假絲酵母(Candida utilis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、異常威克漢姆酵母(W ickerhamomyces anomalus)，引起脹包比例為56.25%、15.63%、12.505%、9.38%、6.25%。

由表1可以看出，中間假絲酵母(Candida intermedia)存在于配料區(qū)、灌裝區(qū)、灌裝機膜倉和包材間，葡萄牙棒孢酵母(C lavispora lusitaniae)僅存在于灌裝區(qū)和包材間的空氣中，產朊假絲酵母(Candida utilis)存在于配料區(qū)、灌裝區(qū)和包材間空氣中，熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)主要存在于灌裝區(qū)、灌裝機膜倉和包材間的空氣中。4類污染酵母菌在灌裝區(qū)數(shù)量最多，其次為包材間，因此，產品中酵母主要是通過灌裝間的空氣和包材間的空氣污染的。加強灌裝間和包材間空氣質量的消毒清潔，是防止酵母菌污染產品的關鍵控制點。

引起產品污染的異常威克漢姆酵母(W ickerhamomycesanomalus)在車間環(huán)境中沒有分布，推測可能是由于包裝材料表面自身帶菌而引起產品的污染。因此，加強車間環(huán)境控制的同時，應嚴格控制包裝材料的微生物質量，以杜絕由包材導致的產品問題。

3 結論與討論

引起酸奶脹包的主要微生物為大腸菌群和能夠發(fā)酵產氣的酵母菌。由于大腸菌群在較低的pH值環(huán)境下很難生長，而酵母菌在3.0～7.5的范圍內均可生長，其最適PH值為4.5～5.0，因此，酸奶中酵母菌的污染，受到所有企業(yè)的重點關注。本文通過對車間環(huán)境中酵母菌的分布和污染產品的酵母菌研究，建立酵母菌的關鍵污染途徑，為產品中酵母菌污染的防控措施提供重要的依據(jù)。

通過本文可知，空氣環(huán)境中存在的酵母菌共7個屬，分別為假絲酵母屬(Candida spp.)、棒孢酵母屬(C lavispora spp.)、紅酵母屬(Rhodotorula spp.)、囊酵母屬(Zygoascus spp.)、絲孢酵母屬(Trichosporon spp.)、鐵艾酵母屬 (Tilletiopsis spp.)、隱球酵母屬(C ryptococcus spp.)。污染產品的微生物主要為假絲酵母屬(Candida spp.)、棒孢酵母屬(C lavispora spp.)和W ickerhamomyces spp.，其中，假絲酵母屬(Candida spp.)污染比例高達78.13%，與車間酵母菌屬的分布比例相符，說明產品中大部分的污染微生物來自于車間的環(huán)境。

表1 車間環(huán)境中酵母菌的分布

圖1 生產環(huán)境中不同酵母菌的污染比例

表2 產品中污染酵母分類及比例

在5種污染酵母菌中，前4種分布在配料區(qū)、灌裝區(qū)、灌裝機膜倉和包材間中，根據(jù)酸奶的生產工藝，配料完成后會進入巴氏殺菌程序，因此，配料區(qū)存在的酵母菌不足以引起產品的污染，最主要的污染途徑有2種，一種是灌裝車間的空氣帶入的污染，一種是包裝車間的空氣間接引起的污染。由于包裝材料能直接接觸到產品，包材間的空氣質量，也必須引起重視，不能疏忽。

食品生產車間常用的空氣消毒方法有空氣過濾、紫外線消毒、臭氧消毒、熏蒸消毒、雙氧水消毒、化學氣溶膠噴霧消毒、靜電吸附等，每種辦法都有其適用的范圍和使用的局限性[12]，因此選用合適的消毒方法對酵母菌的控制起到關鍵性作用。由于灌裝車間和包裝材料都會直接接觸產品，建議使用經(jīng)濟、安全、無害的消毒劑，如食品級雙氧水，不含有毒有害雜質，用噴霧器將消毒溶液噴灑在空氣中，即可起到對生產空間消毒的效果[13]。同時加大對灌裝車間和包材間的消毒頻次，以降低酵母菌的擴散與繁殖。

在對車間環(huán)境進行嚴格管控的同時，已有部分學者開始尋找能夠有效抑制酸奶中霉菌和酵母菌的益生菌[14-16]。通過車間環(huán)境消毒和優(yōu)良菌種的篩選，可以有效的解決酸奶中酵母菌的污染問題。

[1]MOREIRA SR,SCHWAN R F,CARVALHO E P,et al.Isolation and identification of yeastsand filamentous fungi from yoghurts in Brazil[J].Brazilian Journalof M icrobiology,2001,32(2):117-122.

[2]趙泰霞,孟祥晨,張巧云.酸奶中污染酵母菌和霉菌的分離及鑒定[J].食品工業(yè)科技,2012,33(2):189-192.

[3]張雪,趙玉娟,張莉,等.脹包酸奶有害酵母菌的分離鑒定[J].中國乳品工業(yè),2014,42(1):27-30.

[4]王雯,陳曉蔚,張蕾.江蘇地區(qū)酸奶中酵母菌的污染狀況及貨架期內污染狀態(tài)變化分析[J].檢驗檢疫學刊,2013,23(3):35-37.

[5]盧鑫.引起酸奶漲包的馬克思克魯維酵母的分離鑒定及特性研究[D].河北農業(yè)大學,2009.

[6]FELL JW,BOEKHOUT T,FONSECA A,SCORZETTIG,et al.Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determ ined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis[J].Int JSyst EvolM icrobiol,2000,50(3):1351-1371.

[7]LACHANCEM A,DANIEL H M,MEYER W,et al.The D1/D2 domain of the large-subunit rDNA of the yeast species Clavispora lusitaniae is unusually polymorphic[J].FEMS Yeast Res,2003,4(3):25-38.

[8]胡芹,楊曉紅,郭冬琴,劉超怡,周志欽,焦必寧.橙汁中兩株條件致病酵母菌形態(tài)及分子鑒定[J].食品科學,2011,32(9):231-235.

[9]ARIASC R,BURNSJK,FRIEDRICH LM,etal.Yeast speciesassociated w ith orange juice:evaluation of different identification methods[J].Applied and Environmental M icrobiology,2002,68(4):1955-1961.

[10]倪慧娟,包秋華,孫天松,等.新疆地區(qū)酸馬奶中酵母菌的鑒定及其生物多樣性分析[J].微生物學報,2007,47(4):578-582.

[11]范佳,武偉偉,李艷.26S rDNA序列分析法鑒定開菲爾發(fā)酵液中的酵母菌[J].釀酒科技.2014,11:14-17.

[12]方道贈,陳力巨,鄭小樂.食品生產車間空氣的消毒方法[J].肉類工業(yè),2011,6:42-44.

[13]汪永超.食品級雙氧水及其在食品行業(yè)中的應用[J].食品工業(yè)科技,2004,25(3):141-142.

[14]李晶,王鑫,高鵬飛,等.益生菌在酸奶生產過程中對酵母和霉菌污染的控制[J].中國乳品工業(yè),2013,41(9):21-24.

[15]常偉.抗腐敗酵母乳酸菌的篩選及特性分析[D].西華大學,2014.

[16]李紅娟.抗真菌乳酸菌的篩選及特性研究[D].中國農業(yè)科學院,2011.