郭家鼎，郝 佳，李夢(mèng)榮，王譽(yù)程，劉二偉

中藥補(bǔ)骨脂為豆科植物（Psocalea corylicolia L．）的果實(shí)，具有補(bǔ)腎壯骨、升達(dá)脾胃、納氣止瀉的功效，其主要藥效成分是香豆素類化合物補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及其對(duì)應(yīng)的糖苷類化合物補(bǔ)骨脂苷（PO）、異補(bǔ)骨脂苷（IPO），文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂原藥材中PO、IPO的含量高于補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素[1]。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，可與許多內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合[2]。開展藥物與血漿蛋白相互作用研究是每個(gè)藥物開發(fā)過程中必須進(jìn)行的研究工作。牛血清白蛋白（BSA）與人血清白蛋白（HSA）具有極好的結(jié)構(gòu)相似性，且前者易于獲取和具有高度穩(wěn)定性[3]，所以在研究中常作為HSA的替代品。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素與血漿蛋白結(jié)合的研究已有相關(guān)報(bào)道[4]，但其糖苷類化合物PO、IPO的相應(yīng)研究還未見報(bào)道。本文利用紫外吸收光譜法和熒光光譜法首次研究PO和IPO與BSA的相互作用，為補(bǔ)骨脂的安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 熒光分光光度計(jì)（F-7000，日立高新技術(shù)有限公司）；超級(jí)恒溫水浴箱（天津歐諾儀器有限公司）；紫外檢測(cè)器（Agilient 1260高效液相色譜儀）；十萬分之一天平（瑞士 Mettler Toledo公司，AX-205）；超純水制造機(jī)（Millipore公司，Mill-QⅡ型）。

1.2 試劑 PO，IPO（天津西瑪科技有限公司）；布洛芬Ibu、BSA、磷酸鹽緩沖液PBS（索萊寶科技有限公司）；華法林鈉War（天津渤爾特科技有限公司）；8-苯胺基-1-萘磺酸鈉ANS-Na（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純化水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 儲(chǔ)備溶液配制 以PBS緩沖溶液（pH 7．4溶劑配制 1．0×10-4mol/L的 BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，PO和IPO配成1×10-2mol/L標(biāo)準(zhǔn)液備用，均在0～4℃冰箱中保存。

2.2 紫外光譜研究 移取100 μL 1．0×10-3mol/L藥物溶液、一定量的BSA溶液于1．5 mL離心管中，以PBS緩沖溶液（pH 7．40）定容至1 mL，掃描得到190～400 nm紫外吸收光譜。

2.3 熒光光譜研究

2.3.1 熒光淬滅光譜 移取100 μL 5．0×10-5mol/L BSA溶液和一定量的PO與IPO溶液于1．5 mL離心管中，以pH 7．40的PBS緩沖溶稀釋至1 mL，得到不同濃度的PO和IPO待測(cè)溶液，其濃度從1到8 依次是 0、0．2、0．5、1、1．5、2、2．5、3×10-4mol/L。實(shí)驗(yàn)過程中，為了避免內(nèi)濾光效應(yīng)，使BSA的終濃度為5×10-6mol/L。工作液至于37℃水浴中溫育1 h，分取樣品100 μL至于96孔板中，制備4個(gè)復(fù)孔。激發(fā)波長278 nm，進(jìn)行300～500 nm的全波長掃描，激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫分別是5 nm，掃描速度240 nm/min。記錄樣品在37℃條件下的熒光發(fā)射光譜。

2.3.2 同步熒光掃描圖譜 以240 nm為激發(fā)波長，300 nm為發(fā)射波長（Δλ=60 nm），測(cè)定加入藥物后體系的同步熒光光譜。藥物濃度濃度從1到8依次是 0、0．2、0．5、1、1．5、2、2．5、3×10－4mol/L。

2.3.3 三維熒光掃描圖譜 激發(fā)波長的范圍240～320 nm；發(fā)射波長范圍300～450 nm，其他參數(shù)同熒光發(fā)射光譜。

2.3.4 位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn) 固定BSA的濃度，向藥物-BSA體系分別加入一定量的競(jìng)爭(zhēng)試劑：位點(diǎn)Ⅰ（SiteⅠ）的探針試劑為War，位點(diǎn)Ⅱ（SiteⅡ）的探針試劑為Ibu，在激發(fā)波長為278 nm，發(fā)射波長為340 nm處測(cè)定其熒光強(qiáng)度，所得數(shù)據(jù)用來計(jì)算藥物與BSA結(jié)合常數(shù)。

2.3.5 疏水探針ANS 結(jié)合研究：實(shí)驗(yàn)（1），將PO/IPO 加入到 BSA-ANS-Na（CBSA：CANS-Na=1∶1）體系中，PO/IPO 濃度變化范圍為 0～3×10－4mol/L，設(shè)置激發(fā)波長為375 nm，記錄ANS-Na在最大發(fā)射波長465 nm處的熒光值；實(shí)驗(yàn)（2），將PO/IPO加入到BSA-ANS-Na（CBSA：CANS-Na=1∶1）體系中，PO/IPO 濃度變化范圍為 0～3×10－4mol/L，設(shè)置激發(fā)波長為 278nm，記錄BSA在最大發(fā)射波長340 nm處的熒光值，所得數(shù)據(jù)用來計(jì)算藥物與BSA鍵合常數(shù)。

3 結(jié)果

圖1 PO（A）和IPO（B）對(duì)BSA的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 UV/vis absorbance spectra of PO(A)or IPO(B)in the absence and presence of BSA

3.1 紫外/可見吸收光譜研究 紫外/可見吸收光譜法方法簡單適用于探索結(jié)構(gòu)變化和了解復(fù)合物的形成[5]。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)固定BSA的濃度，不斷增加藥物濃度時(shí)，在BSA最大吸收波長處有干擾，因此為了考察PO、IPO與BSA相互作用，實(shí)驗(yàn)固定藥物濃度，測(cè)試不同濃度BSA與一定量的藥物作用的紫外/可見吸收光譜。如圖1所示，隨著BSA濃度的增加，藥物的紫外吸收光譜呈現(xiàn)了增色效應(yīng)，提示可能是因?yàn)槎甙l(fā)生了相互作用，導(dǎo)致了BSA構(gòu)像發(fā)生變化。但是藥物和BSA相互作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討，因此，進(jìn)行了熒光光譜研究。

3.2 PO和IPO對(duì)BSA的淬滅作用及其結(jié)合常數(shù)研究 如圖2A所示，當(dāng)激發(fā)光波長為278 nm時(shí)，BSA熒光發(fā)射峰位置在339 nm附近，且PBS緩沖液及兩種藥物在339 nm附近無明顯的熒光發(fā)射，對(duì)實(shí)驗(yàn)不造成干擾。本實(shí)驗(yàn)以PBS作為參比溶液，采用背景扣除法修正參比溶液的背景熒光得到如圖2B-C熒光淬滅圖譜。由圖2B-C可知，固定BSA的濃度不變，隨著PO和IPO濃度的增加，BSA熒光強(qiáng)度逐漸下降，最大發(fā)射波長發(fā)生了約2 nm的輕微紅移，說明PO和IPO對(duì)BSA具有明顯的熒光淬滅作用。又如圖2B-C所示，PO和IPO對(duì)BSA的熒光淬滅圖譜中均出現(xiàn)了等發(fā)射點(diǎn)，表明PO和IPO與BSA的相互作用過程中產(chǎn)生了新的化合物，導(dǎo)致其對(duì)BSA的熒光淬滅行為。

熒光淬滅作用分為動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，無論是動(dòng)態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，全部遵循Stern－Volmer方程[12]：

由Stern-Volmer方程擬合得到的圖3顯示，在一定的藥物濃度范圍內(nèi)（0-3×10-4mol/L），F(xiàn)0/F與[D]線性關(guān)系良好，且由表1可知，37℃時(shí)，PO和IPO對(duì)BSA熒光淬滅速率常數(shù)均為3．1×1011L/（mol·s），大于各類熒光淬滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)2．0×1010L/（mol·s），說明PO和IPO對(duì)BSA的熒光淬滅是因?yàn)樾碌慕Y(jié)合物生成而引起，即靜態(tài)淬滅，這與上述熒光淬滅圖譜的結(jié)果一致。

圖2 BSA熒光圖譜（A）及PO（B）、IPO（C）對(duì)BSA的熒光淬滅圖Fig.2 Fluorescence spectra of BSA in the absence(A)and presence of PO(B)or IPO(C)

靜態(tài)淬滅過程也可以用修正的Stern-Volmer方程分析[6]，

根據(jù)方程（2）擬合得到線性方程F0/（F0－F）～1/[D]，見圖4。由截距和斜率計(jì)算得到37℃時(shí)PO和IPO對(duì)BSA的結(jié)合常數(shù)Ka，詳見表1。

藥物在BSA上結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的推算多采用修正后的Scatchard方程[7]，圖5為利用lg[（F0-F）/F]～lg[D]作圖得到的藥物-BSA體系的Scatchard圖：

由圖5的直線斜率計(jì)算得到37℃時(shí)藥物分子在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n并列于表1中。PO和IPO在在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別是1．11和0．94，說明藥物在BSA上只存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，即藥物與BSA以1∶1的比例進(jìn)行結(jié)合。

3.3 PO和IPO對(duì)BSA位點(diǎn)確定研究 HSA上至少有兩個(gè)特異的高親和藥物結(jié)合位點(diǎn)，分別稱為siteⅠ和siteⅡ。許多藥物對(duì)HSA的結(jié)合具有特異性[8]，如War結(jié)合于siteⅠ，Ibu結(jié)合于siteⅡ，這兩個(gè)藥物可以用作位置探針。BSA與HSA結(jié)構(gòu)上有極高的相似度，因此，選擇 War、Ibu 分別作為 siteⅠ、siteⅡ的探針?biāo)幬?，從而研究探針?biāo)幬锱cPO和IPO的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合情況，確定藥物在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，探針?biāo)幬锱cBSA按1∶1比例混合，同時(shí)加入到含有不同濃度的藥物溶液中。在3種探針?biāo)幬锎嬖谙拢鶕?jù)方程（2）分析熒光淬滅數(shù)據(jù)，相關(guān)熒光參數(shù)列于表1。根據(jù)方程（3）所得的結(jié)合位點(diǎn)n約為1，說明探針?biāo)幬锏拇嬖诓]有改變PO和IPO在BSA上結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，證實(shí)了上述PO和IPO在BSA上均有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)論。由表1可知，探針I(yè)bu存在時(shí)，IPO對(duì)BSA的結(jié)合常數(shù)Ka變小幅度最大，表明Ibu與IPO同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)同一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但是探針試劑的加入并沒有對(duì)PO的結(jié)合常數(shù)造成影響。

圖3 PO（A）和IPO（B）對(duì)BSA的Stern-Volmer擬合圖Fig.3 Stern-Volmer curve of BSA fluorescence quenching treated with different concentrations of PO(A)or IPO(B)

圖 4 PO（A）和 IPO（B）對(duì) BSA 的 F0/(F0-F)～1/[D]擬合圖Fig.4 Plot of F0/(F0-F)versus 1/[D]for fluorescence quenching of BSA by PO(A)or IPO(B)

圖 5 PO（A）和 IPO（B）對(duì) BSA 的 lg[F0-F)/F]～lg[D]擬合圖Fig.5 Plot of lg[F0-F)/F]versus lg[D]for quenching process of PO(A)or IPO(B)with BSA

表1 藥物-BSA體系及藥物-BSA/探針體系在PBS緩沖液（pH=7.4）中和T=37℃條件下的熒光參數(shù)Tab.1 Fluorescence parameters of drug-BSA system and Drug-BSA/probeSysteminPBSbuffer(pH=7.4)andT=37℃

3.4 ANS置換探針 ANS在極性環(huán)境中沒有明顯的熒光發(fā)射，但是與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合后熒光信號(hào)增強(qiáng)[8]，所以本實(shí)驗(yàn)選用疏水性探針試劑ANSNa研究BSA與PO/IPO之間相互作用的性質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)（1）中，將不同濃度的PO/IPO加入到BSA-ANS體系，藥物濃度變化范圍0～3×10-4mol/L，記錄ANS相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0（F0：未加藥物時(shí)ANS熒光值，F(xiàn)：加入不同濃度藥物時(shí)ANS熒光值）隨藥物濃度變化趨勢(shì)，得圖6，如圖所示隨著藥物濃度的增加ANS熒光值變小。ANS是一個(gè)廣譜性熒光探針，在BSA上有5個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但是當(dāng)ANS與BSA濃度比為1∶1時(shí)，其主要結(jié)合位點(diǎn)主要位于SiteⅡ[9]，因此推測(cè)PO/IPO與ANS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合BSA致使ANS熒光強(qiáng)度下降。利用ANS進(jìn)行了第二系列實(shí)驗(yàn)，ANS對(duì)PO/IPO與BSA結(jié)合常數(shù)的影響結(jié)果列于表1，發(fā)現(xiàn)ANS使PO/IPO結(jié)合常數(shù)Ka變小，再一次對(duì)PO/IPO在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)是SiteⅡ的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

3.5 PO和IPO對(duì)BSA構(gòu)象影響研究 使用同步熒光光譜可以探測(cè)蛋白質(zhì)氨基酸微環(huán)境的改變，而血清白蛋白的熒光發(fā)射的特性主要來自色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的貢獻(xiàn)，其中Trp熒光強(qiáng)度最大，因此Trp的熒光猝滅可以用來表征藥物與BSA的結(jié)合關(guān)系及BSA形態(tài)的變化[10]。本實(shí)驗(yàn)把Trp的同步熒光光譜作為定性判斷BSA構(gòu)象變化的依據(jù)，見圖 7。當(dāng) Δλ=λem-λex=60 nm時(shí)，同步熒光顯示為Trp的熒光行為。如圖7所示，固定BSA的濃度不變，隨著藥物濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸下降，最大發(fā)射波長發(fā)生了約3 nm的輕微紅移，表明藥物對(duì)BSA的構(gòu)象造成了輕微的影響，使Trp所處的微環(huán)境極性略有增加。

三維熒光圖譜可以同時(shí)改變發(fā)射波長和激發(fā)波長，從而提供熒光體的熒光特性信息[11]。圖8為BSA、PO-BSA和IPO-BSA的三維熒光圖譜。如圖8所示，峰1主要是tyr和try熒光發(fā)射行為，隨著PO和IPO的加入，峰1的熒光值下降，表明tyr和try的微環(huán)境發(fā)生了變化，PO和IPO與BSA之間的相互作用導(dǎo)致BSA構(gòu)象發(fā)生了變化，這與同步熒光發(fā)射圖譜顯示的結(jié)果一致。

圖6 疏水熒光探針ANS在PO/IPO作用下的相對(duì)熒光圖譜Fig.6 Displacement of fluorescent probes from HSA by drugs(PO/IPO)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法對(duì)PO和IPO在生理狀態(tài)下對(duì)BSA的熒光淬滅方式、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、以及PO和IPO對(duì)BSA構(gòu)象的影響進(jìn)行了研究。從熒光淬滅光譜、同步熒光光譜及三維熒光光譜可以看出，PO和IPO對(duì)BSA產(chǎn)生靜態(tài)淬滅作用，并且對(duì)BSA的構(gòu)象產(chǎn)生了輕微影響。根據(jù)表1結(jié)果可知，PO和IPO對(duì)BSA之間有較弱的結(jié)合。根據(jù)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PO和IPO的在BSA上的主要結(jié)合位點(diǎn)在SiteⅡ。

圖7 PO（A）和IPO（B）對(duì)BSA同步熒光光譜圖Fig.7 Influence of PO(A)or IPO(B)on synchronous fluorescence spectra of BSA

圖 8BSA（A）、PO-BSA（B）和 IPO-BSA（C）的三維熒光圖譜Fig.8 Three-dimensional fuorescence spectra of BSA in the absence(A)and presence of PO(A)or IPO(B)

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