賈秀娟，張晨曦，趙艷敏，劉岱琳，賀凌霜，晁亮

（1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津300309；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

根皮素（Phloretin）化學(xué)名為3-（4-羥基苯基）-1-（2，4，6-三羥基苯基）-1-丙酮，主要分布于蘋(píng)果、梨等多汁水果的果皮及根皮中，具有降血糖、心血管保護(hù)、抗氧化、抗炎、免疫抑制和美白等多種藥理作用[1]，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。

根皮素具有豐富的生物活性，因此近年來(lái)很多學(xué)者專注于根皮素的結(jié)構(gòu)改造研究。有學(xué)者利用化學(xué)合成的方法對(duì)根皮素的乙酰阿魏酸酯[2]、異煙?；闧3]和乙基醚化[4]等衍生物進(jìn)行合成；也有學(xué)者利用生物酶對(duì)根皮素的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，獲得了一系列新的糖苷化產(chǎn)物[5]，但是利用微生物菌種對(duì)根皮素進(jìn)行轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道較少。本課題組前期從24種真菌中篩選出包括菌株AS3.521在內(nèi)的4株真菌對(duì)根皮素具有轉(zhuǎn)化作用，在此基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化底物根皮素消耗率的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這4株菌株的轉(zhuǎn)化效率也較高[6]。本期在前期工作基礎(chǔ)上系統(tǒng)研究菌株AS3.521對(duì)根皮素的轉(zhuǎn)化，研究結(jié)果對(duì)根皮素的生物合成和生物轉(zhuǎn)化提供可以借鑒的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根皮素對(duì)照品（純度為90%）：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、無(wú)水乙醇（分析純）：天津市康科德科技有限公司；超純水：天津市職業(yè)與環(huán)境危害仿制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；DNA Marker、2×TaqMasterMix、引物 ITS1、引物 ITS4、ddH2O：北京博邁德生物技術(shù)有限公司；BIOWESTAGAROSE瓊脂糖：上海玉博生物科技有限公司；EB（Ethidium bromide）染料：北京全式金生物技術(shù)有限公司（TRANS）；菌株AS3.521：天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室自有的菌種。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-QX全溫振蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；SB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FA1204B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀（檢測(cè)器：SPD-M20A，柱溫箱：CTO-20A，雙泵：LC-20A，控制器：CBM-20A）、泵：Shi madzu LC-6AD、Shimadzu PRC-ODS，40 mm×250 mm，5 μm：日本島津公司；Cosmosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：Nacalai Tesque；Bruker AV-400 核磁共振波譜儀、Bruker DRX-400 spectrometer（1H-NMR 400 MHz，13C-NMR 100 MHz）：布魯克公司；制備型高效液相色譜儀：紫外檢測(cè)器：UV3000：北京創(chuàng)新恒通科技有限公司；微量進(jìn)樣器：TM#702 0.025 mL：美國(guó)Hamilton公司；Solarbio真菌基因組DNA提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；GeneAmp PCR System 9700 PCR儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；離心機(jī)：賽默飛世爾科技有限公司；Bio-rad瓊脂糖凝膠電泳儀、Bio-rad照膠儀：北京伯樂(lè)生命科學(xué)發(fā)展有限公司；Olympus CKX41光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS光學(xué)儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高速振蕩器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；DZKW-D-2電熱水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的鑒定

將菌株接種于PDA平皿培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出成型的菌落后，觀察記錄菌落的形態(tài)特征。

通過(guò)ITS序列分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定：取生長(zhǎng)在斜面培養(yǎng)基中活化后生長(zhǎng)狀態(tài)正確的供試菌株，刮取菌絲體50 mg～100 mg，利用Solarbio真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌種DNA，并應(yīng)用通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和 ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）對(duì)提取得到的DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：25 μL2×Taq Master Mix，2 μLITS4 引物，2 μLITS5 引物，1 μLDNA以及20 μL ddH2O。反應(yīng)過(guò)程：94℃預(yù)處理5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min；循環(huán) 30次，最后在72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后取5.0 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)ED染料染色后在PCR儀中進(jìn)行觀察。將PCR產(chǎn)物委托上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到的測(cè)序結(jié)果在國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中 GenBank 中進(jìn)行序列檢索并與Genbank中基因進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)生物軟件Mege7.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.2 菌株AS3.521孢子菌懸液的配制

向保存于固體斜面培養(yǎng)基中的AS3.521菌株中加入無(wú)菌水，用接種環(huán)充分刮取菌體，通過(guò)紗布過(guò)濾，制成104CFU/mL的孢子菌懸液，備用。

1.3.3 菌株AS3.521的生長(zhǎng)曲線的建立

利用微量移液槍吸取1 000 μL上述菌懸液接種到100 mL的液體牛肉膏培養(yǎng)基中，用8層紗布封好瓶口，放入全溫振蕩器中。在28℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min下培養(yǎng)。每隔6小時(shí)或12小時(shí)取出一組空白培養(yǎng)瓶和加藥樣品瓶，搖勻后取出適量用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600nm下測(cè)定發(fā)酵液的OD值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 菌株AS3.521對(duì)根皮素的轉(zhuǎn)化

每200 mL PDA液體培養(yǎng)基中加入2 mL1.3.2項(xiàng)下的孢子菌懸液，在28℃、160 r/min條件下培養(yǎng)48 h后，加入用70%甲醇溶解的根皮素溶液（10 mg/mL）6 mL，使得底物（根皮素）濃度為0.3 mg/mL，同時(shí)設(shè)置只加入6 mL甲醇溶液而無(wú)底物的發(fā)酵組作為對(duì)照組。在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天后，減壓抽濾，去除菌絲體后合并濾液即得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的培養(yǎng)液。

1.3.5 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

將累積的1.3.4項(xiàng)下的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物培養(yǎng)液用等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至干，得到浸膏 15.2 g，利用大孔樹(shù)脂 HP20（45 cm×3.7 cm）進(jìn)行分離，以水，30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脫，得到 5 個(gè)梯度組分（組分 1～5）。組分 2（1.16 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0～94∶6，體積比）梯度洗脫，獲得5個(gè)洗脫組分（組分6～10）。其中組分8（105.7 mg）進(jìn)行反相制備液相純化，甲醇-水（15 ∶85）洗脫獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 1（21.6 mg）。將組分 9（33.8 mg）進(jìn)行反相制備液相純化，甲醇-水（15∶85，體積比）洗脫獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 2（1.4 mg）和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 3（1.8 mg）。所得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別用氘代甲醇溶解，置于核磁管中，利用核磁共振儀進(jìn)行碳譜、氫譜數(shù)據(jù)測(cè)定。

圖1 菌株AS3.521菌落形態(tài)Fig.1 The forms of strain AS3.521

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌株AS3.521的鑒定

菌株AS3.521在PDA固體平皿培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長(zhǎng)較快，3天后可見(jiàn)成型菌落，對(duì)其進(jìn)行觀察，見(jiàn)圖1。

如圖1所示，菌株呈圓形，直徑1.5 cm～3 cm，邊緣整齊，中間青綠色邊緣有少許白色，菌絲較為緊密，呈絨狀。菌落背面呈3個(gè)同心圓，中心黃褐色，外圈綠色，最外圈白色。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》，初步推測(cè)菌株AS3.521屬于青霉屬。

菌株AS3.521的ITS測(cè)定結(jié)果表明，擴(kuò)增的序列全長(zhǎng)550 bp。將測(cè)序得到的DNA序列進(jìn)行檢索后選取菌株序列與AS3.521菌株序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2。

圖2 菌株AS3.521的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of strain AS3.521

如圖2所示，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中發(fā)現(xiàn)，菌株AS3.521與Penicillium chrysogenum位于同一分支，說(shuō)明二者具有同源性，親緣關(guān)系最為接近。并且二者在Genbank中的相似值達(dá)99%。且結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》的相關(guān)內(nèi)容，將菌株AS3.521鑒定為產(chǎn)黃青霉。這和實(shí)驗(yàn)室最初關(guān)于菌株AS3.521的記載相一致，說(shuō)明菌株AS3.521在實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期的菌種傳代保藏過(guò)程中未發(fā)生變種。

2.2 菌株AS3.521生長(zhǎng)曲線的建立

每隔6小時(shí)/12小時(shí)對(duì)AS3.521菌株進(jìn)行OD值的測(cè)定。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，得到AS3.521生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖3。

從生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉菌前6 h其生長(zhǎng)極為緩慢，6 h之后生長(zhǎng)速度加快，從6 h～42 h是其生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)時(shí)期，生長(zhǎng)較為迅速，并在42 h達(dá)到生長(zhǎng)最大值，42 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，生長(zhǎng)較為平穩(wěn)。因此，我們選擇在42 h時(shí)加入底物根皮素，以使菌株AS3.521能夠充分轉(zhuǎn)化根皮素。

圖3 菌株AS3.521的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of strain AS3.521

2.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

累積得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物按“1.3.5”項(xiàng)下操作，通過(guò)柱色譜分離后得到3個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：

化合物 1：白色粉末（甲醇），1H-NMR（400 MHz，in CD3OD），δ：7.02（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6），6.68（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），2.8（2H，t，J=7.6 Hz，H-8），2.5（2H，t，J=7.6 Hz，H-7）；13C-NMR（400 MHz，MeOH），δ：180.1（C-9），155.3（C-4），131.5（C-1），128.7（C-2，6），114.7（C-3，5），35.8（C-8），29.8（C-7）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]對(duì)照，鑒定化合物1為對(duì)羥基苯丙酸。

化合物 2：白色粉末（甲醇），1H-NMR（400 MHz，in CD3OD），δ：7.07（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.70（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5）；13C-NMR（400 MHz，MeOH），δ：178.2（C-7），157.3（C-4），131.3（C-2 ，6），127.3（C-1），116.2（C-3 ，5），經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)[8-9]數(shù)據(jù)比對(duì)，鑒定化合物2為對(duì)羥基苯甲酸。

圖4 轉(zhuǎn)化路徑的推測(cè)Fig.4 The speculation of conversation approach

化合物 3：白色粉末（甲醇），1H-NMR（400 MHz，in CD3OD），δ：7.85（2H，dd，J=6.8，1.9Hz，H-2，6），6.81（2H，dd，J=6.8，1.9 Hz H-3，5），3.83（3H，s，OCH3）；13C-NMR（400 MHz，MeOH），δ：178.3（C-7），132.7（C-2，6），116.3（C-3，5），52.2（OCH3），以上波譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[10]報(bào)道的茴香酸數(shù)據(jù)相一致，所以鑒定化合物3為茴香酸。

2.4 轉(zhuǎn)化路徑的推測(cè)

微生物代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的酶，因此微生物發(fā)酵過(guò)程就是形成產(chǎn)酶系統(tǒng)的過(guò)程?；谖墨I(xiàn)，根據(jù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，推測(cè)該菌種代謝中的酶[11]主要有裂解酶和甲基化酶，見(jiàn)圖4。

如圖4所示，底物根皮素在裂合酶的作用下，C=O與C-1′鍵斷裂，并在P450氧化酶的作用下，得到產(chǎn)物對(duì)羥基苯丙酸。根皮素在裂合酶的作用下，C=O與其α碳連接鍵發(fā)生斷裂，C-2′和C-6′位發(fā)生去羥基化，得到對(duì)羥基苯甲酸，之后在甲基化酶的作用下，得到產(chǎn)物茴香酸。

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化路徑的推測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，菌株AS3.521產(chǎn)黃青霉具有很強(qiáng)的裂解作用，并具有甲基化酶，可以對(duì)化合物進(jìn)行裂解以及甲基化作用，在以后的化合物合成過(guò)程中加以擴(kuò)大應(yīng)用。根皮素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的液相分析見(jiàn)圖5。

圖5 根皮素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的液相分析Fig.5 HPLC analysis of biotransformation compounds from phloretin

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、ITS序列分析以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒定并鑒定了實(shí)驗(yàn)室保存的AS3.521菌株確實(shí)為產(chǎn)黃青霉菌，說(shuō)明菌株在傳代保藏過(guò)程中保存良好，未發(fā)生變種。本文詳細(xì)研究了該菌種對(duì)根皮素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。首先利用測(cè)定OD值的方法建立了AS3.521產(chǎn)黃青霉菌的生長(zhǎng)曲線，選取并確定了最優(yōu)加入底物時(shí)間。通過(guò)定量給予培養(yǎng)基、孢子懸液，在28℃、160 r/min條件下培養(yǎng)后通過(guò)多種柱色譜結(jié)合的方法，共分離得到3個(gè)小分子裂解轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，本文的研究結(jié)果為利用微生物的方法對(duì)根皮素進(jìn)行生物合成奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陸曉宇,曹耀英,葉燕霞,等.根皮素的抗炎和免疫抑制作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2009,44(5)：480-485

[2]李翠蘋(píng),余燕影,曹樹(shù)穩(wěn).根皮素乙酰阿魏酸酯的合成及抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2012,24(3)：316-320

[3]李靜,余燕影,曹樹(shù)穩(wěn).根皮素異煙?；甑暮铣伞⒈碚骷翱寡趸钚匝芯縖J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2011,23(5)：824-827

[4]魏麗娜.根皮素胺乙基醚化修飾及其生物活性、安全性研究[M].西安：陜西師范大學(xué),2015

[5]H Overwin,V Wray,B Hofer.Biotransformation of phloretin by amylosucrase yields three novel dihydrochalcone glucosides[J].Journal of Biotechnology,2015,211：103-106

[6]崔雨,趙艷敏,魏小聰,等.根皮素的微生物轉(zhuǎn)化篩選及消耗率的測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2016,37(8)：166-169

[7]邵建華,張玉偉,王金輝,等.蓬萊菜的化學(xué)成分[J].中國(guó)藥物化學(xué)雜志,2009,4(19)：288-289

[8]盧丹,劉金平,趙軼卓,等.穿龍薯蕷地上部分的化學(xué)成分(Ⅱ)[J].中草藥,2010,41(5)：700-703

[9]李艷茸,李春,王智民,等.藏藥甘青烏頭化學(xué)成分研究 (Ⅲ)[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(7)：1163-1167

[10]張明星,盛喆.對(duì)羥基苯丙酸的制備與應(yīng)用[J].精細(xì)與專用化學(xué)品,2010,9(18)：48-49

[11]陶軍華.生物催化在制藥工業(yè)的應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010