鄧麗娟，洪霞，錢瀅文，*，王克輝，周鑫魁，劉琦，吳麗華

（1.甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010；2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司，甘肅蘭州730010）

黑枸杞即黑果枸杞，屬于茄科枸杞屬。味甜多汁，營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為荒漠中的“軟黃金”和“黑珍珠”，極具研究和開發(fā)價值[1]。國內(nèi)以青海黑枸杞品質(zhì)最好。黑枸杞含有豐富的花色苷，使其呈現(xiàn)獨特的黑色，花色苷又具有顯著的抗氧化活性，近幾年深受國人的追捧[2]。

亞臨界水是指在適宜的溫度和壓力下，只要水保持為液態(tài)，這種液態(tài)水稱為亞臨界水。這種液態(tài)水對溫度敏感，其極性會隨溫度變化而變化。亞臨界水的物理、化學(xué)特性與常溫常壓下的水有較大差別，隨著溫度的升高，水的極性、表面張力和黏度都急劇下降，對中極性和非極性化合物的溶解能力會大大增加，其性質(zhì)更接近于有機(jī)溶劑。亞臨界水物理、化學(xué)特性的改變，主要與流體微觀結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子水合、離子締合、簇狀結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。水在常溫常壓下介電常數(shù)約為80，而升溫升壓至250℃、5 MPa時，水的介電常數(shù)降低到27，這個值和25℃、0.1 MPa下的乙醇相同，這表明亞臨界水對中極性和非極性化合物具有一定的溶解能力[3-5]。亞臨界水類似于有機(jī)溶劑，具有價廉、零污染的特點，在植物有效成分提取分離中得到了迅速發(fā)展。亞臨界水提取是一種極具潛力開發(fā)成為工業(yè)化生產(chǎn)的綠色提取技術(shù)[4-8]。本研究通過單因素及正交試驗優(yōu)化黑枸杞亞臨界水提取工藝，對黑枸杞中6種花青素含量進(jìn)行了測定，建立了亞臨界水提取高效液相色譜法測定黑枸杞花青素含量的方法。以期對黑枸杞中花青素的進(jìn)一步開發(fā)提供一種綠色高效的新型技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑枸杞干果：原產(chǎn)青海，市售黑枸杞；50 mL亞臨界高壓反應(yīng)釜：北京世紀(jì)森朗試驗儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海亞榮儀器廠；AG720EKF－NS微波爐：廣東美的微波爐制造有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀DAD檢測器：美國安捷倫科技有限公司；XB220A電子天平：普利賽斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；SB-5200DNT超聲清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；J-HH-4A精密數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海皓莊儀器有限公司。自組裝亞臨界水提取設(shè)備示意圖見圖1。

1.2 試劑

飛燕草色素94.5%、矢車菊色素96.8%、矮牽牛色素92.0%、天竺葵色素95.0%、芍藥素97.0%、錦葵色素94.8%標(biāo)準(zhǔn)品：均購自美國ChromaDex公司；檸檬酸（優(yōu)級純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；鹽酸（優(yōu)級純）：西隴科技股份有限公司；乙醇、乙腈、甲醇均為色譜純：Fisher公司。

圖1 自組裝亞臨界水提取設(shè)備示意圖Fig.1 Schematic diagram of self-assembled subcritical water extraction equipment

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確稱取飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素6種花青素標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用10%鹽酸甲醇溶液溶解并定容至10 mL容量瓶，作為單標(biāo)儲備液。-18℃避光保存6個月。將單一標(biāo)準(zhǔn)貯備液混合用10%鹽酸甲醇溶液逐級稀釋成 0.5、1.0、5.0、25.0、50.0 mg/L 作為標(biāo)準(zhǔn)曲線使用液。以峰面積對溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。6種花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見表1。

表1 6種花青素標(biāo)準(zhǔn)回歸方程Table 1 Six kinds of anthocyanin standard regression equation

6種花青素在0～1 μg之間線性良好。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動相A為1.0%甲酸水溶液，B為乙腈為梯度洗脫0～5 min，88%A～90%A；10 min～15 min，80%A～85%A；15 min～20 min，70%A～75%A；20 min～30 min，88%A～90%A。柱溫35℃；檢測波長530 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 亞臨界水提取單因素試驗

將黑枸杞粉碎，過40目篩。稱取制備好的黑枸杞1.00 g裝入反應(yīng)釜中，加超純水，用檸檬酸調(diào)pH2.5，分別固定反應(yīng)釜溫度、提取時間、提取壓力、料液比中的3個，以一個為變量來做單因素試驗。以提取液中總花青素含量為考察指標(biāo)，依次進(jìn)行下列4個單因素試驗：萃取溫度（90、100、110、120、130、140 ℃）、萃取時間（10、14、18、22、26、30 min）、萃取壓力（3、6、9、12、15、18 MPa）料液比 [1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]?？疾旄饕蛩氐牟煌綄μ崛∫褐谢ㄇ嗨睾康挠绊慬9-11]。

1.3.4 最佳工藝條件的確定

在確定了單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取4個因素各自較優(yōu)的3個水平進(jìn)行正交試驗，采用L9（34）設(shè)計進(jìn)行正交試驗獲取最佳工藝參數(shù)。因素水平表見表2。

表2 因素水平表Table 2 Factor and level table

1.3.5 回流法

稱取制備好的黑枸杞粉1.00 g于50 mL具塞比色管中，加無水乙醇∶水∶鹽酸按體積比2∶1∶1的提取液至刻度線，超聲提取30 min，沸水浴中水解1 h。立即避光冷卻，定容至50 mL。取上層清液過0.45 μm聚醚砜濾膜，待測[12-14]。

1.3.6 微波法

稱取黑枸杞干粉1.00 g于燒杯中，加入60%乙醇140 mL，微波功率600 W，提取140 s。取上層清液過0.45 μm 聚醚砜濾膜，待測[15-16]。

1.3.7 結(jié)果計算

樣品中花青素含量為6種花青素含量之和。其含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計，含量單位為mg/kg，按下面的公式進(jìn)行計算：

式中：ρ為待測液各花青素質(zhì)量濃度，mg/L；V為定容體積，mL；m 試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與計算

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度的影響

提取溫度對花青素含量的影響見圖2。

由圖2可以看出在90℃～120℃之間，隨著溫度的升高花青素含量增加，說明在這一溫度范圍內(nèi)花青素在亞臨界水中的溶解度隨溫度升高而增大。這是因為溫度升高，水的極性降低，使花青素更易被提取出來；同時，升高溫度可以降低水黏度，使水更容易被滲入黑枸杞中，然而當(dāng)溫度超過120℃后，提取率明顯下降，提取液顏色逐漸加深褐變，這是由于花青素不耐高熱，開始降解所致。Tom?ik等[17]利用亞臨界提取大蒜提取物時，提取溫度也存在同樣的趨勢變化。因此，120℃為最佳提取溫度。

2.1.2 提取時間的影響

提取時間對花青素含量的影響見圖3。

圖2 提取溫度對花青素含量的影響Fig.2 Extraction temperature on anthocyanin content

圖3 提取時間對花青素含量的影響Fig.3 Extraction time on anthocyanin content

由圖3可以看出，隨提取時間的延長，花青素含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢。22 min內(nèi)，隨著提取時間的延長花青素含量顯著增加，但超過22 min后明顯下降，這是因為亞臨界水提取黑枸杞中花青素的傳質(zhì)過程，是一個花青素在溶劑作用下通過分子擴(kuò)散運(yùn)動達(dá)到固-液相平衡的過程，到達(dá)平衡狀態(tài)需要一定的時間，因此平衡前適當(dāng)?shù)匮娱L提取時間有利于更多成分的溶出，可提高提取效率，時間過長會導(dǎo)致部分花青素發(fā)生降解，致使提取效率降低。Truong等[18]加壓提取紫甘薯中花色苷時，發(fā)現(xiàn)長時間的高溫高壓會使花色苷大幅降解。18 min～22 min提取效果差異不大，為了節(jié)約時間，因此選擇18 min為最佳提取時間。

2.1.3 提取壓力的影響

提取壓力對花青素含量的影響見圖4。

由圖4可知，壓力對花青素含量的影響很小，從3 MPa～18 MPa之間花青素含量相差不到0.02%。亞臨界水提取時，壓力只是讓水保持在液態(tài)狀態(tài)，壓力的變化對水極性的影響極小。該結(jié)果現(xiàn)象與文獻(xiàn)[19-20]報道相吻合。高壓力對儀器的要求就會更高，提取成本也會有所增加，所以選擇9 MPa作為提取壓力。

2.1.4 料液比的影響

料液比對花青素含量的影響見圖5。

圖4 提取壓力對花青素含量的影響Fig.4 Extraction pressure on anthocyanin content

圖5 料液比對花青素含量的影響Fig.5 The ratio of liquid to anthocyanin content

從圖5可以看出，隨料液比增大，花青素含量大幅增加，在料液比為1∶30（g/mL）時，花青素含量從4 897.3 mg/kg達(dá)到6 427.1mg/kg。這是由于溶劑量增多，更多溶劑滲透進(jìn)黑枸杞，黑枸杞與溶劑的接觸面積增大，對花青素的溶解增多，從而所提取出的花青素含量升高。但液料比過大會造成溶劑的浪費，提取時間也會相對延長，所以取料液比為1∶30（g/mL）比較合適。

2.2 最佳提取工藝的確定

利用上述4個因素以花青素含量為判斷指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交試驗，尋求獲得最佳的提取參數(shù)，并考察各因素對花青素含量影響的主次順序。正交試驗因素水平和提取工藝正交試驗結(jié)果見表3。

表3 L9（34）正交試驗與極差分析Table 3 L9（34）orthogonal test and range analysis

圖6 6種花青素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.6 6 kinds of anthocyanin standard chromatogram

由表3極差分析得出，各因素對提取效果的影響的主次順序為提取溫度（A）＞料液比（D）＞提取時間（B）＞提取壓力（C），最優(yōu)因素水平組合為 A3B2C2D3，即提取溫度為120℃，提取時間為18 min，提取壓力為9 MPa，料液比為1∶30（g/mL）。經(jīng)試驗驗證該條件下提取的黑枸杞花青素含量為6 862.4 mg/kg，高于正交表中任意一組含量，與理論分析結(jié)果一致。

2.3 花青素定量分析

圖6、圖7分別為6種花青素色譜圖和亞臨界法提取黑枸杞花青素色譜圖。

通過對比圖6和圖7各自保留時間和光譜圖，可以確定黑枸杞中提取液中含有4種花青素，分別為飛燕草色素、矮牽牛色素、芍藥素和錦葵色素。其中矮牽牛色素含量最高占總花青素含量的79.5%。

圖7 亞臨界法提取黑枸杞花青素色譜圖Fig.7 Subcritical extraction of black wolfberry anthocyanin chromatogram

2.4 不同提取方法比較

不同提取方式對花青素的提取效果見表4。

表4 不同提取方式花青素含量（n=3）Table 4 Different extraction methods anthocyanin content（n=3）

從表4可以看出，亞臨水提取花青素效果完全不遜色于現(xiàn)已成熟的傳統(tǒng)微波法和回流法，亞臨界水提取花青素原料無需干燥，設(shè)備簡單易組裝，無需太高壓力，十幾分鐘內(nèi)就能完全有效的提取黑枸杞花青素，無有機(jī)溶劑添加，安全無污染，顯示出決定性的優(yōu)勢。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗分析獲得亞臨界水提取黑枸杞花青素的最佳工藝參數(shù)為提取溫度為120℃，提取時間為18 min，提取壓力為9 MPa，料液比為1∶30（g/mL）。通過液相色譜分析得出黑枸杞中花青素有4種，分別為飛燕草色素、矮牽牛色素、芍藥素和錦葵色素，其中矮牽牛色素含量最高?？偦ㄇ嗨睾繛? 862.4 mg/kg。

通過試驗比較了微波法、回流法和亞臨界水提取法，發(fā)現(xiàn)亞臨界水對黑枸杞花青素的提取效果與傳統(tǒng)回流法相當(dāng)。且此法對花青素原料要求較低，設(shè)備簡單易組裝，提取時間短，效果好，無污染，為黑枸杞中花青素的進(jìn)一步開發(fā)提供一種綠色高效的新型技術(shù)。

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