王曉敏，林霖雨，李康麗，田川堯，蔡鋒隆，楊華，洪中山

（天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津300384）

淮山藥（Dioscorea opposita thumb）是薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷，別名又稱山藥、土薯、山薯、山蕷等，是一種常見的中藥[1]。除了藥用價值外，山藥還是一種常見的食材，即藥食同源[2]。山藥的營養(yǎng)成分包括淀粉、蛋白質和游離氨基酸等；其生物活性成分含多糖（黏液質和糖蛋白）、尿囊素、膽堿多酚氧化酶等。其中，山藥多糖被認為是山藥的主要活性物質，其在抗氧化、抗衰老、促進腸胃功能和提高免疫力等方面均具有生理活性[3]。

根據(jù)山藥多糖溶于水，不溶于乙醇的性質，傳統(tǒng)山藥多糖的提取方法為水提醇沉法。為了提高山藥多糖的提取率，可在水提醇沉的基礎上采用超聲波輔助，這種方法可以借助超聲波產(chǎn)生的空化效應、機械效應、熱效應和其他次級效應，在不改變多糖結構的基礎上，提高提取率[4]。本文采用超聲波輔助提取法提取山藥多糖，通過正交試驗確定超聲波輔助提取法提取山藥多糖的最佳條件并探討其體外抗氧化活性，為山藥多糖的利用和天然安全食品抗氧化劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淮山藥：天津市紅旗農(nóng)貿(mào)市場；山藥多糖（按本試驗最佳提取條件提取所得，經(jīng)鹽酸法脫蛋白后純度達73.23%）；DPPH自由基（1，1-二苯基-2-苦肼基自由基）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；羥自由基清除能力測定試劑盒、HPLC＞98%維生素C、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚：北京索萊寶生物技術有限公司；試驗用水為離子交換水。

1.2 儀器與設備

JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-9240ME數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FZ102微型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52旋轉蒸發(fā)儀：上海雅榮生化設備儀器廠；UV-800紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山藥多糖的制備

淮山藥自然陰干至沒有黏液狀態(tài)后轉至60℃恒溫干燥箱烘干至恒重、粉碎機粉碎、過60目篩。稱取一定量預處理的山藥粉末放置在燒杯中，加入蒸餾水，在某一超聲時間、超聲功率、料液比和水浴浸提時間條件下提取山藥多糖。提取液于3 000 r/min離心機中離心15 min，濾渣重復上述操作，進行二次提取；合并兩次上清液于旋轉蒸發(fā)儀中，在70℃條件下旋轉蒸發(fā)至原體積的1/3，再加入3到4倍體積的95%乙醇，室溫下，靜置過夜。醇沉后的液體3 000 r/min離心15 min后取上清液。將所得上清液再放置于旋轉蒸發(fā)儀中，60℃條件下旋轉蒸發(fā)至粘稠狀態(tài)，將所得粘稠液置于60℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，經(jīng)研缽研磨即可得山藥粗多糖。

1.3.2 山藥多糖含量的測定

采用苯酚-濃硫酸法測定山藥多糖含量[5]。測定時的最大吸收波長為483 nm（在紫外波長200 nm～700 nm下掃描得到）。由葡萄糖標準曲線回歸方程計算樣品溶液的山藥多糖濃度，依據(jù)公式（1）計算樣品溶液山藥多糖百分含量[5]。

式中：C為樣品溶液對應的葡糖糖濃度，mg/mL；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；f為換算因子，0.9；W為樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗

準確稱取2 g山藥多糖粉末，按照一定料液比加入去離子水于100 mL燒杯中。將此燒杯放入裝有冰水混合物的大燒杯中，再將其放入超聲波細胞破碎機中，在預設的超聲波功率下提取一段時間后，再轉入60℃水浴鍋中浸提一段時間，提取液于3 000 r/min離心機離心15 min，濾渣重復上述操作，合并兩次濾液，取1 mL濾液定溶于10 mL容量瓶中，采用苯酚-濃硫酸法測定山藥多糖含量，確定最佳超聲時間、超聲功率、料液比和水浴浸提時間。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗基礎上，采用L9（34）正交表進行正交試驗設計。

1.3.5 山藥多糖體外抗氧化性研究

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基存在多個吸電子的-NO2和苯環(huán)的大π鍵，因此其含有穩(wěn)定的氮自由基，呈暗紫色，當抗氧化劑（山藥多糖）消除DPPH自由基時，其最大吸收波長517 nm處的吸光度值隨之減小，因此在某一濃度下對應的吸光度值越小，其抗氧化能力越強[6]。取2 mL不同濃度的山藥多糖溶液和0.000 2 mol/L DPPH自由基溶液（溶劑為95%乙醇），混勻后在室溫條件下避光反應20 min，以相同體積的乙醇和蒸餾水調零，在517 nm處測吸光度。依據(jù)公式（2）計算不同濃度山藥多糖的DPPH自由基清除率。

式中：As為試驗組吸光度值，2 mL樣品溶液+2 mL DPPH自由基溶液；Ac為對照組吸光度值，2 mL樣品溶液+2 mL 95%乙醇；Ab為空白組吸光度值，2 mL蒸餾水+2 mL DPPH溶液。

1.3.5.2 羥自由基清除率的測定

Fenton反應可產(chǎn)生羥自由基，并將鄰二氮菲-Fe2+水溶液中的Fe2+氧化為Fe3+，其呈色與羥自由基的多少呈正比關系，即536 nm處吸光度越小，樣品對羥自由基的清除能力越強[7]。取250 μL不同濃度的山藥多糖溶液，按試劑盒說明書操作，在536 nm處測定其吸光度值。試驗設空白組（Ab）、對照組（Ac）和試驗組（As）。依據(jù)公式（3）計算不同濃度山藥多糖的羥自由基清除率。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基清除率的測定

參照劉璐等人的文獻，用鄰苯三酚自氧化法測定山藥多糖對超氧陰離子自由基的清除率[8]。以蒸餾水為空白Ab，于325 nm處測定混合物吸光度值As，依據(jù)公式（4）計算不同濃度山藥多糖的超氧陰離子自由基清除率。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

以葡糖糖濃度（x）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程Y=0.010 4x+0.006（R2=0.995 8），說明葡萄糖在 30 μg/mL～210 μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。標準曲線見圖1。

圖1 葡糖糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲時間對多糖提取率的影響

固定超聲功率600 W，水浴浸提時間30 min，料液比 1 ∶20（g/mL），考察山藥多糖分別在 10、20、30、40、50、60 min超聲時間下的多糖提取率，結果見圖2。

圖2 超聲時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasound time on the polysaccharide yield

超聲時間10 min～40 min內(nèi)，多糖提取率逐漸增大；超聲時間40 min時多糖提取率達到最大值；之后，隨時間的延長，多糖提取率變化趨于平穩(wěn)。因此，最佳超聲時間為40 min。

2.2.2 超聲功率對多糖提取率的影響

固定超聲時間40 min，水浴浸提時間30 min，料液比 1 ∶20（g/mL），考察山藥多糖分別在 200、400、600、800、1 000 W功率下的多糖提取率，結果見圖3。

圖3 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasound power on the polysaccharide yield

在200 W～800 W范圍內(nèi)，多糖提取率逐漸增大，到800 W時達到最大值；此后多糖提取率下降。因此，最佳超聲功率為800 W。

2.2.3 料液比對多糖提取率的影響

固定超聲功率800 W，超聲時間40 min，水浴浸提時間 30 min，考察山藥多糖分別在 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）料液比下的多糖提取率，結果見圖4。

圖4 料液比對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of solid to water ratio on the polysaccharide yield

料液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶15（g/mL）時，多糖提取率大幅度增加；1 ∶15（g/mL）～1 ∶25（g/mL）時，多糖提取率下降，隨后變化較為平緩。因此，選擇料液比1∶15（g/mL）最為合適。

2.2.4 浸提時間對多糖提取率的影響

固定超聲功率800 W，超聲時間40 min，料液比1 ∶15（g/mL），考察山藥多糖在 10、20、30、40、50 min 水浴浸提時間下的多糖提取率，結果見圖5。10 min～20 min，多糖提取率緩慢上升；20 min～30 min，多糖提取率大幅上升；此后，隨時間增加，多糖提取率開始下降。因此，最佳水浴浸提時間為30 min。

2.3 正交試驗

依據(jù)單因素試驗結果，采用L9（34）正交表對超聲波輔助法提取山藥多糖的最佳條件進行優(yōu)化。因素水平編碼表見表1。正交試驗結果見表2。

圖5 水浴浸提時間對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of water bath extracting time on the polysaccharide yield

表1 因素水平設計L9（34）Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

根據(jù)正交試驗結果和極差分析可以看出：各因素對山藥多糖提取率的影響主次順序為：B＞A＞C＞D，即：超聲功率＞超聲時間＞物料比＞水浴浸提時間。根據(jù)K值的大小可知最佳提取工藝條件為：A2B2C1D2，即：超聲時間40 min，超聲功率800 W，料液比1∶10（g/mL），60℃水浴浸提時間30 min。驗證該條件下的山藥多糖提取率，結果分別為15.16%、15.31%、15.22%，平均多糖提取率達15.23%。

2.4 山藥多糖體外抗氧化性的研究

2.4.1 DPPH自由基清除率

不同濃度山藥多糖清除DPPH自由基能力測定結果如圖6所示，顯著性分析見表3。

圖6 DPPH自由基的清除率Fig.6 The scavenging rate to DPPH free radical

表3 顯著性分析（n=6）Table 3 Analysis of significant（n=6）

在4.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，山藥多糖和對照組VC清除DPPH自由基能力均逐漸增強。當多糖濃度在1.5 mg/mL～2.5 mg/mL時，對照組VC清除DPPH自由基能力強于山藥多糖，差異極顯著（P＜0.01）；當多糖濃度在2.5 mg/mL～4.0 mg/mL時山藥多糖清除DPPH自由基能力接近或強于對照組VC，差異不顯著（P＞0.05），說明只有在山藥多糖的含量達到一定濃度時才有較強的清除DPPH自由基的能力。

2.4.2 羥自由基清除率

不同濃度山藥多糖清除羥自由基能力測定結果如圖7所示，顯著性分析見表4。

在4.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，山藥多糖和VC清除羥自由基能力均逐漸增加。當多糖濃度在1.5 mg/mL～2.5 mg/mL時山藥多糖清除羥自由基能力與對照組VC幾乎相等，差異不顯著（P＞0.05）；當多糖濃度在3.0 mg/mL～4.0 mg/mL時山藥多糖清除羥自由基能力高于對照組 VC，差異顯著（P＜0.05）。

圖7 羥基自由基的清除率Fig.7 The scavenging rate to hydroxyl free radical

表4 顯著性分析（n=6）Table 4 Analysis of significant（n=6）

2.4.3 超氧陰離子自由基清除率

不同濃度山藥多糖清除超氧陰離子自由基能力測定結果如圖8所示，顯著性分析見表5。

圖8 超氧陰離子自由基清除率Fig.8 The scavenging rate to superoxide anion free radical

在3.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，山藥多糖和VC清除超氧陰離子自由基能力均逐漸增加，且清除能力相接近。但當濃度超過1.5 mg/mL時，山藥多糖的清除能力高于對照組 VC，差異顯著（P＜0.05）。

表5 顯著性分析（n=6）Table 5 Analysis of significant（n=6）

3 結論

本文用超聲波輔助法提取淮山藥多糖，在超聲時間 40 min，超聲功率 800 W，料液比 1∶10（g/mL），60℃水浴浸提時間30 min，提取2次時，山藥多糖的提取率為15.23%；所提多糖有較好的體外抗氧化活性，且與質量濃度呈一定計量效應關系，當山藥多糖的濃度分別達到4.0、4.0、3.0 mg/mL時，山藥多糖對DPPH、羥基、超氧陰離子自由基的清除能力分別達到86%、82%和63%。

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