張劍，弓志青，賈鳳娟，崔文甲，王月明，王文亮

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100）

金針菇（Flammulina velutipes）別名冬菇、樸菇、構(gòu)菌、青杠菌、毛柄金錢菌等，在真菌學(xué)領(lǐng)域中屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，金錢菌屬[1]。金針菇因其形美，味鮮，且富含多糖、蛋白質(zhì)、鈣、鐵、磷、多種維生素等物質(zhì)，已成為世界上知名的欣賞菌和食藥兩用菌[2]。

金針菇多糖作為金針菇的主要活性物質(zhì)之一，具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、提高機(jī)體免疫力[7]等多種生理性功效。目前有關(guān)金針菇粗多糖或單一多糖組分的生物活性的研究較多[8-10]，而提取分離純化過(guò)程中進(jìn)行多糖活性追蹤的研究較少，鄒宇曉等研究了純化過(guò)程中金針菇多糖體外抗腫瘤活性的變化，結(jié)果表明，抗腫瘤活性最高的是未經(jīng)純化處理的金針菇粗多糖，說(shuō)明分離純化工藝對(duì)多糖抗腫瘤活性有影響[11]。對(duì)不同純度的多糖樣品進(jìn)行活性研究，這直接影響到多糖功能食品開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵工藝，對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制極為重要。而金針菇多糖制備過(guò)程中其抗氧化活性的變化研究還少有報(bào)道。

本文以金針菇水提液、醇沉多糖以及脫蛋白多糖為研究對(duì)象，以總抗氧化能力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力及抑制羥基自由基能力為檢測(cè)指標(biāo)，研究3種純度的粗多糖體外抗氧化活性，旨在探討金針菇多糖在制備過(guò)程中體外抗氧化活性的變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電熱恒溫水浴鍋（DK-8D）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平（AR423CN）：奧豪斯（上海）儀器有限公司；高速離心機(jī)（LXJ-IIB）：上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV6000）：上海元析儀器有限公司；小型粉碎機(jī)（ZN-20L）：北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司。

金針菇：濟(jì)南大潤(rùn)發(fā)超市，產(chǎn)地濟(jì)南；DPPH：北京中生瑞泰科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)：Biosharp公司；牛血清蛋白：Biofroxx；總抗氧化能力測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：A015）、抑制羥自由基能力測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：A018）：南京建成生物工程研究所；其它均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 樣品制備

將金針菇進(jìn)行整理去雜后60℃干燥至恒重，粉碎，過(guò)80目篩。運(yùn)用熱水浸提的工藝料液比1∶30（g/mL）、溫度90℃、時(shí)間4 h、提取2次，獲取金針菇多糖水提液，冷凍干燥得金針菇多糖水提物，命名為FVP1；通過(guò)乙醇沉淀和冷凍干燥得金針菇粗多糖，命名為FVP2；經(jīng)Sevage法去蛋白和冷凍干燥得到金針菇脫蛋白多糖，命名為FVP3。將FVP1、FVP2、FVP3置于干燥器中備用。

1.3 多糖含量測(cè)定

采用苯酚硫酸法聯(lián)合3，5-二硝基水楊酸法（DNS）測(cè)定金針菇多糖純化過(guò)程中的含量，其中苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量，DNS法檢測(cè)還原糖的含量，二者之差即為多糖含量，即多糖含量=總糖含量-還原糖含量[12]。兩種方法均以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，所得的回歸方程分別為y=15.614x+0.003 29，R2=0.999 76；y=1.671 6x-0.049，R2=0.999 9。將待測(cè)樣品FVP1、FVP2、FVP3配置成合適的濃度按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)吸光值計(jì)算待測(cè)樣品中多糖含量。

1.4 抗氧化試驗(yàn)

1.4.1 總抗氧化能力檢測(cè)

將 FVP1、FVP2、FVP3配置成2.0 mg/mL的試樣，運(yùn)用南京建成生物工程研究所試劑盒（貨號(hào)：A015）測(cè)定，詳細(xì)步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。其原理是：具有抗氧化性的物質(zhì)可以將Fe3+還原成Fe2+，生成的Fe2+可與菲啉類物質(zhì)生成穩(wěn)定的絡(luò)合物，通過(guò)比色測(cè)定便可得知其抗氧化能力高低。定義：在37℃下，每毫升樣品每分鐘使反應(yīng)體系的吸光值每增加0.01時(shí)，即為一個(gè)總抗氧化能力單位（U）。計(jì)算公式：

式中：反應(yīng)液總量為3.7 mL；取樣量為0.1 mL。

1.4.2 DPPH自由基清除能力

采用弓志青等的方法[13]，其原理：DPPH自由基上有單電子，溶于醇溶液中呈現(xiàn)紫色，在515 nm～520 nm范圍內(nèi)有強(qiáng)吸收。自由基清除劑可以與DPPH自由基的單電子配對(duì)，導(dǎo)致其吸收逐漸消失，顏色也由深紫色變成黃色。褪色程度與所接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此可用分光光度計(jì)來(lái)進(jìn)行定量分析[14]，具體操作：將 FVP1、FVP2、FVP3 分別配置成 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的試樣，加樣順序見(jiàn)表1，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm下測(cè)定吸光值，并按以下公式計(jì)算清除率I。

表1 清除DPPH自由基試驗(yàn)樣品添加量Table 1 Sample addition for DPPH scavenging test

1.4.3 抑制羥基自由基能力

將 FVP1、FVP2、FVP3 分別配置成 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的試樣，運(yùn)用南京建成生物工程研究所試劑盒（貨號(hào)：A018）測(cè)定，詳細(xì)步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。其原理：依據(jù)Fenton反應(yīng)，H2O2的量與Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH量成正比，當(dāng)給予電子受體后，加入griess試劑進(jìn)行顯色，便形成紅色物質(zhì)，顏色深淺與·OH的多少成正比關(guān)系。定義在37℃下1 min反應(yīng)，使反應(yīng)體系中H2O2濃度降低1 mmol/L所需的樣品量為1個(gè)抑制羥自由基能力單位（U）。

計(jì)算公式：

式中：標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8.824mmol/L；取樣量為0.2mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測(cè)定

FVP1、FVP2、FVP3中的多糖含量及得率見(jiàn)表2。

表2 多糖含量及得率Table 2 Content and yield of polysaccharide

隨著純化的進(jìn)行，多糖含量逐漸提高，即FVP3＞FVP2＞FVP1，其中FVP3的多糖含量達(dá)55.21%；而多糖的得率卻逐漸降低，即FVP1＞FVP2＞FVP3，其中FVP3的多糖得率僅有1.52%。

2.2 抗氧化試驗(yàn)

2.2.1 總抗氧化能力

不同純度的金針菇粗多糖總抗氧化能力由總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒測(cè)定見(jiàn)表3和圖1。

表3 純化工藝對(duì)金針菇多糖總抗氧化能力的影響Table 3 Effect of purification process on total antioxidant capacity of Flammulina velutipes polysaccharide

圖1 FVP1、FVP2、FVP3的總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of FVP1，F(xiàn)VP2，F(xiàn)VP3

由表3和圖1可知，2.0 mg/mL的 FVP1、FVP2、FVP3的總抗氧化能力逐漸下降，總抗氧化能力依次為6.221、3.831、1.197 U/mL，這說(shuō)明純化工藝有降低金針菇粗多糖的總抗氧化能力的趨勢(shì)。

2.2.2 DPPH自由基清除能力

不同純度的金針菇粗多糖的DPPH自由基清除能力見(jiàn)表4和圖2。

表4 純化工藝對(duì)金針菇多糖DPPH自由基清除能力的影響Table 4 Effect of purification process on DPPH radical scavenging activity of Flammulina velutipes polysaccharide

續(xù)表4 純化工藝對(duì)金針菇多糖DPPH自由基清除能力的影響Continue table 4 Effect of purification process on DPPH radical scavenging activity of Flammulina velutipes polysaccharide

圖2 FVP1、FVP2、FVP3的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of FVP1，F(xiàn)VP2，F(xiàn)VP3

在0.5 mg/mL～2.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，不同純度的FVP1、FVP2、FVP3的DPPH自由基清除能力均具有濃度依賴性，隨著濃度的增高，其能力也逐漸提高，其中FVP1在2.0 mg/mL的濃度下的清除能力最強(qiáng)，為45.69%；在相同的濃度下，DPPH自由基清除能力的大小依次為FVP1＞FVP2＞FVP3，而且隨著濃度的增加，DPPH自由基清除能力的降幅逐漸增大，這說(shuō)明，純化工藝有減弱金針菇粗多糖DPPH自由基清除能力的趨勢(shì)。

2.2.3 抑制羥基自由基能力

不同純度的金針菇粗多糖抑制羥基自由基能力見(jiàn)表5和圖3。

表5 純化工藝對(duì)金針菇多糖抑制羥自由基能力的影響Table 5 Effect of purification process on hydroxyl radical restraining capacity of Flammulina velutipes polysaccharide

續(xù)表5 純化工藝對(duì)金針菇多糖抑制羥自由基能力的影響Continue table 5 Effect of purification process on hydroxyl radical restraining capacity of Flammulina velutipes polysaccharide

圖3 FVP1、FVP2、FVP3的抑制羥基自由基能力Fig.3 Hydroxyl radical restraining capacity of FVP1，F(xiàn)VP2，F(xiàn)VP3

在0.5 mg/mL～2.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，不同純度的FVP1、FVP2、FVP3的抑制羥基自由基能力均具有濃度依賴性，隨著濃度的增高，其能力也逐漸提高。其中FVP1在2.0 mg/mL的濃度下的清除能力最強(qiáng)，為98.70%；在相同的濃度下，F(xiàn)VP1與FVP2的抑制羥基自由基的能力相當(dāng)，變化不是很大，而FVP3的抑制羥基自由基的能力卻大幅度下降。這說(shuō)明，純化過(guò)程中的脫蛋白有減弱金針菇粗多糖抑制羥基自由基能力的趨勢(shì)。

3 討論

據(jù)報(bào)道，金針菇多糖具有抗氧化活性，其主要是通過(guò)提高超氧化物歧化酶的活性，進(jìn)而有效清除自由基，起到抗氧化的作用[8]。葉敏等[15]檢測(cè)了金針菇多糖清除羥自由基能力，結(jié)果顯示多糖對(duì)羥自由基有一定的清除能力，并且具有濃度依賴性；李守勉等[16]采用結(jié)晶紫法測(cè)定了金針菇多糖清除自由基的能力，結(jié)果表明金針菇多糖對(duì)羥基自由基有良好的清除效果。本試驗(yàn)中不同濃度的金針菇多糖均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，尤其是抑制羥基自由基的能力較強(qiáng)。

多糖的活性與很多因素有關(guān)，比如相對(duì)分子質(zhì)量、溶解度、結(jié)構(gòu)等的改變均會(huì)影響多糖的活性。通常一定相對(duì)分子質(zhì)量的具備三股螺旋結(jié)構(gòu)的β-1，3葡聚糖活性較高[17]。目前金針菇多糖的制備主要通過(guò)提取、分離、純化等，步驟繁多，中間還涉及有機(jī)溶劑的加入等，金針菇多糖的結(jié)構(gòu)難免不會(huì)破壞[8]，而多糖的生物活性很大程度上是由其結(jié)構(gòu)決定的，這就有可能造成其活性下降。另外Seavge法去除蛋白質(zhì)的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致多糖的流失，一方面，除去變性膠狀蛋白時(shí)會(huì)有少量多糖溶于其中；另一方面，有些多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合形成糖蛋白或者蛋白聚糖，也會(huì)隨著蛋白的變性沉淀下來(lái)，造成多糖的損失[18]。另外，有些金針菇多糖還可以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式來(lái)發(fā)揮其生物活性[19]，蛋白質(zhì)的去除必然會(huì)影響其相應(yīng)的生物活性。這可能是本研究中FVP3即脫蛋白多糖抗氧化活性最低的原因。

4 結(jié)論

本研究中FVP1、FVP2、FVP3粗多糖樣品的得率（相對(duì)于金針菇原料）分別為54.9%、9.26%、1.52%，純度逐漸升高，依次為10.35%、19.48%、55.21%；FVP1、FVP2、FVP3均有一定的體外抗氧化活性，其中抑制羥自由基能力最強(qiáng)，DPPH自由基清除能力次之，總抗氧化能力最弱。在本試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，3種純度粗多糖的抗氧化能力呈劑量效應(yīng)，但抗氧化能力大小卻隨著純度的升高而降低，這說(shuō)明多糖的分離純化工藝有降低其體外抗氧化能力的影響，尤其是脫蛋白工藝。無(wú)論是從生產(chǎn)成本上，還是抗氧化活性上，F(xiàn)VP1較為經(jīng)濟(jì)適用。

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