呂國英 王 霄 宋婷婷張作法*

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兩株野生桑黃液體發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性比較

呂國英1王 霄2宋婷婷1張作法1*

（1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，浙江 杭州 310021；2. 浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310014）

以采自四川和安徽的兩株野生桑黃液體發(fā)酵所得的菌絲體和發(fā)酵液為比較分析對象，檢測其抗氧化活性。結(jié)果表明，發(fā)酵液和菌絲體對DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的清除能力均較強，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性；黃酮含量與抗氧化活性基本呈正相關(guān)；安徽菌株A的抗氧化活性略優(yōu)于四川菌株S。

桑黃；液體發(fā)酵；抗氧化

桑黃（s）是一種大型藥用真菌，主要生長在桑樹等活立木上[1,2]。桑黃提取物具有明顯的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫等一系列藥理作用，目前已成為藥用真菌研究領(lǐng)域的熱點[3]。由于桑黃有嚴格的寄主選擇和特殊的環(huán)境要求，自然界中子實體生長緩慢，且大量的人工采伐導致野生桑黃越來越少。桑黃雖能人工栽培，但所需條件苛刻，獲得效率低下，目前難以實現(xiàn)規(guī)?；耘?。桑黃較容易分離培養(yǎng)，菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)能獲得大量的代謝物，有些活性物質(zhì)含量比子實體還要高，而且生產(chǎn)周期短、易于控制，不受季節(jié)氣候限制，并可自動化控制規(guī)模化生產(chǎn)[4]。對其活性成分研究最多的是多糖抗腫瘤活性，其次為抗氧化作用。

本研究以兩株野生桑黃液體發(fā)酵后菌絲體和發(fā)酵液為指標，考察其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力，以期為該種藥用真菌的功能性成分提取和保健產(chǎn)品的開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：桑黃菌株S和A，分別采自四川和安徽的活桑樹，經(jīng)分離純化獲得，保存在本實驗室。試劑： DPPH、ABTS、過硫酸鉀購自Sigma；其他的試劑為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基（g/L）配方：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。PDA液體培養(yǎng)基（g/L）配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。

1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

從活化的斜面培養(yǎng)基上取一定量的菌絲塊接種到裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，150 r/min、25 ℃下振蕩培養(yǎng)8天。

1.4 樣品制備

將發(fā)酵液進行減壓抽濾，收集抽濾所得的濾液，為發(fā)酵培養(yǎng)液（S培和A培），用于測定抗氧化活性。

1.5 DPPH清除率的測定

1 mL樣品加入1 mL 0.01%的DPPH溶液（乙醇︰二甲基亞砜=1︰1的溶液溶解），振蕩反應30 min后，在517 nm處測定吸光度。以純?nèi)軇┐嫱瑯芋w積的樣品作為空白[5]。

DPPH清除率（%）=（1－A517樣品/A517空白）×100%。

1.6 ABTS+清除率的測定

配制2.46 mM過硫酸鉀，用過硫酸鉀溶解ABTS，配成7 mM ABTS儲備液，在室溫、避光條件下靜置12～16 h；將ABTS+以磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH=7.4）稀釋，使其吸光度在734 nm波長處達到0.7±0.02。然后取4 mL的ABTS+測定液，加入40 μL的樣品待測液，準確振蕩30 s，在734 nm處測定吸光度[6]。

ABTS+清除率（%）=（1－A734樣品/ A734空白）×100%。

1.7 羥自由基清除率的測定

1 mL樣品加入1 mL FeSO4（12 mmol/L），再加入1 mL H2O2（12 mmol/L），37 ℃下保溫10 min，再加入1 mL 6 mmol/L的水楊酸，37 ℃下保溫30 min，然后10 000 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清液在510 nm處測定吸光度。以純?nèi)軇┐嫱瑯芋w積的樣品作為空白[7]。

1.8 黃酮含量的測定

標準曲線的制作：準確稱取25.0 mg蘆丁標準品，用80%乙醇溶解并定容至50.0 mL，即為標準液。標準液分別稀釋為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，各取1 mL，加60 μL 5%的NaNO2，搖勻，靜置5 min，加入60 μL 10%的Al(NO3)3，混勻，靜置6 min，加入0.8 mL 1 M的NaOH溶液，再補充80 μL純水/或者80%乙醇至2 mL總體積。反應10 min，在510 nm下測試吸光度，用80%乙醇代替同樣體積的樣品作為空白。做3組平行測試，最終吸光度值為3次測試的平均值[8]。

以反應體系中蘆丁標準品的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標作標準曲線，計算回歸方程為y = 2.019 9x + 0.046 3，2= 0.996 3。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

有自由基清除劑存在時，·DPPH的單電子被配對而使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小，而且這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)是成化學劑量關(guān)系的。因此可用于檢測自由基的清除情況，從而評價實驗樣品的抗氧化能力。幾個不同濃度梯度的樣品進行了DPPH清除率的測定，結(jié)果見表1。

可以看出，兩個菌株菌絲體和發(fā)酵液均有良好的·DPPH清除能力。菌株A（安徽）的清除效果略優(yōu)于菌株S（四川）；特別是稀釋64倍的A菌株發(fā)酵液的清除率達到100%，完全可以忽略空白培養(yǎng)基本身的清除能力。說明有一大部分的抗氧化物質(zhì)分泌在細胞外。菌株A優(yōu)于菌株S。

表1 發(fā)酵樣品DPPH清除率

注：1/4，1/16等表示稀釋4倍，16倍；培養(yǎng)基空白表示滅菌后未接種。

2.2 清除ABTS+的能力

ABTS經(jīng)過硫酸鉀氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中，在734 nm處有最大吸收。被測物質(zhì)加入ABTS+溶液后所含抗氧化成分能與ABTS+發(fā)生反應而使反應體系褪色。結(jié)果如表2。

可以看出，菌株A的菌絲體和發(fā)酵液的ABTS+清除率都明顯優(yōu)于菌株B；菌株A的發(fā)酵液稀釋16倍后，清除率為94.5%，盡管空白培養(yǎng)基有較大的干擾，但稀釋16倍后基本可以忽略其影響。菌株A明顯優(yōu)于菌株S。

表2 發(fā)酵樣品ABTS+清除率

注：1/4，1/16等表示稀釋4倍，16倍；培養(yǎng)基空白表示滅菌后未接種。

2.3 清除羥自由基的能力

H2O2和Fe2+混合產(chǎn)生羥自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸，可捕捉羥自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸光值。當反應體系中存在·OH自由基清除劑時，此氧化過程受到抑制，吸光度值則降低，通過測定A510，可以間接測定樣品的·OH自由基清除能力。

兩種菌株發(fā)酵液對羥自由基清除能力明顯低于對前兩種自由基的清除能力（表3），空白培養(yǎng)基本身的清除能力對結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾；菌絲體的羥自由基清除效果仍很明顯。菌株S效果略優(yōu)于菌株A。

表3 發(fā)酵樣品羥自由基清除率

注：1/2，1/4等表示稀釋2倍，4倍；培養(yǎng)基空白表示滅菌后未接種。

2.3 黃酮含量

黃酮是一類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物和真菌的次級代謝產(chǎn)物中，具有抗癌、抗衰老、抗炎、降血糖、降血壓、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種功能，還可有效地清除羥自由基等，是一類具有廣闊開發(fā)前景的天然抗氧化劑[9]。本研究中空白的培養(yǎng)液510 nmAbs為0，故可以排除培養(yǎng)液所含物質(zhì)對吸光度的干擾。安徽菌株A的發(fā)酵培養(yǎng)液中黃酮含量為5.25 mg/mL，明顯高于四川菌株S的2.89 mg/mL（圖1）；菌絲體的黃酮含量安徽菌株A略優(yōu)于四川菌株S。發(fā)酵培養(yǎng)液的總黃酮含量要高于菌絲體的細胞破碎液，說明隨著菌種的新陳代謝，有大量的黃酮類物質(zhì)被排出細胞外，進入培養(yǎng)液中。

圖1 樣品中的黃酮含量

3 結(jié)論與討論

研究表明，癌癥、衰老或其他疾病大都與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)，能夠消除過多的氧化自由基，對于許多自由基引起的及與老化相關(guān)的疾病都能起預防作用。本研究中選取幾種典型的自由基為對象，考察桑黃發(fā)酵物對其清除能力。結(jié)果顯示，安徽菌株優(yōu)于四川菌株，特別是安徽菌株發(fā)酵液稀釋64倍，DPPH清除率仍達到100%。兩種菌的發(fā)酵液在稀釋的情況下對幾種自由基的清除率都可以達到100%，這與發(fā)酵液中黃酮含量高有關(guān)。黃酮類化合物因酚羥基上的氫原子可與過氧自由基結(jié)合生成黃酮自由基，進而與其他自由基反應，從而終止自由基鏈式反應[9, 10]。而黃酮類物質(zhì)在植物中普遍存在，但在大型真菌中則很少見。

本研究評價了在液體培養(yǎng)條件下桑黃的抗氧化能力，為其生物活性的研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為進一步開發(fā)利用該藥用真菌提供了理論依據(jù)。

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浙江省“十三五”食用菌育種專項（項目編號：2016C02057-8）

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