肖永樂 ，楊璐一 *，梁歌 ，萬(wàn)小平 ，羅公民 ，呂學(xué)斌 ，王澤洲 ，高榮 **

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物疾病防控與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；3.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

近年來，越來越多的細(xì)胞因子被用作疫苗的分子佐劑[1]，然其成本高，半衰期短，限制了細(xì)胞因子的大規(guī)模使用，亟需開發(fā)安全和性價(jià)比高的免疫調(diào)節(jié)劑來增強(qiáng)動(dòng)物的免疫能力。復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)限制了單個(gè)細(xì)胞因子基因在體內(nèi)的表達(dá)活性，加之單基因的生物學(xué)活性通常達(dá)不到足夠的免疫增強(qiáng)效果，為了克服這個(gè)限制，我們?cè)O(shè)計(jì)了融合的多個(gè)細(xì)胞因子基因，使之能夠在動(dòng)物細(xì)胞中共表達(dá)，加強(qiáng)調(diào)節(jié)效應(yīng)，增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)感染性疾病的免疫保護(hù)能力。這類細(xì)胞因子中最常使用的就是白介素分子[2-4]，本研究中我們用2A自剪切短肽連接豬IL-2和IL-4/6，探究其在體外和小鼠體內(nèi)的免疫協(xié)同效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 重組質(zhì)粒 真核分泌型表達(dá)質(zhì)粒VR1020，插入融合豬IL-4和IL-6的VRIL4/6以及插入豬IL-2的VRIL2均由本單位實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.2 修飾殼聚糖包裹納米顆粒的制備及檢測(cè) 用離子交聯(lián)法制備質(zhì)粒DNA殼聚糖納米顆粒，按文獻(xiàn)報(bào)道的方法[5]先制備殼聚糖聚乙二醇-聚乙烯亞胺修飾分子（CPP），與質(zhì)粒按質(zhì)量比為30∶1的比例在50～55℃水浴磁力攪拌下，將質(zhì)粒緩慢滴加至材料溶液中，混合均勻，恒溫10min，最終得到包裹好的4種納米顆粒：VRIL4/6-2-CPP、VRIL4/6-CPP、VRIL2-CPP、VR1020-CPP。

將納米顆粒樣品進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳。取1mL納米顆粒，用Zetasizer 3000 HS/IHPL納米粒度分析儀測(cè)定粒徑及Zeta電位。

1.3 重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 6孔板中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞至有80%貼壁時(shí)轉(zhuǎn)染4種納米顆粒，每孔緩慢滴加50μL納米顆粒，分別于24h、48h和72h收集上清用于檢測(cè)生物學(xué)活性。

1.4 重組質(zhì)粒的生物學(xué)活性檢測(cè) 用文獻(xiàn)報(bào)道的方法制備豬淋巴母細(xì)胞，96孔板中每孔加入50 μL靶細(xì)胞和50μL轉(zhuǎn)染上清液。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)對(duì)照孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后每孔加入10μL CCK8輕輕吹勻，繼續(xù)培養(yǎng)2h，用Bio-Reader3550檢測(cè)每孔OD450（參照OD630）。

1.5 重組質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng) 將40只21日齡（18～22g）健康昆明雌鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，見表1。每只小鼠注射含有100μg重組質(zhì)粒的納米顆粒，注射后每周稱重并采血。用流式細(xì)胞儀測(cè)量外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的變化；用ELISA檢測(cè)血清中的IgG、和IgG1水平；用熒光定量PCR檢測(cè)血液中免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況。

表1 小鼠分組情況

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、粒徑及Zeta電位 CPP包裹4種質(zhì)粒形成的納米顆粒，通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5種納米顆粒或向正極方向跑，或被阻滯在點(diǎn)樣孔中，說明質(zhì)粒和包裹材料成功地結(jié)合在了一起，形成納米顆粒，并且納米顆粒分子粒徑較小。

4種納米顆粒的粒徑及Zeta電位見表2。從表2可見，所有包裹納米顆粒的平均粒徑在98～154nm之間，Zeta電位在+24.5～+44.7mV之間，說明轉(zhuǎn)染效率較好。

表2 納米顆粒的粒徑和電位

2.2 重組質(zhì)粒的體外生物學(xué)活性 通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞成活結(jié)果（圖1），可見豬淋巴母細(xì)胞明顯增殖，VRIL4/6-2-CPP、VRIL4/6-CPP和 VRIL2-CPP均較對(duì)照VR1020-CPP組增殖明顯。說明實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒用CPP包裹后均能表現(xiàn)出高效的生物學(xué)活性，顯著刺激豬淋巴細(xì)胞增殖（P＜0.05），且 VRIL4/6-2-CPP共表達(dá)實(shí)驗(yàn)組的效果最佳。

圖1 淋巴母細(xì)胞增殖情況

2.3 重組質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)

2.3.1 免疫基因表達(dá)定量分析 從免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的定量分析結(jié)果（圖2）可以看出，實(shí)驗(yàn)組IL-1、IL-2、IL-4三種基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。IL-1和IL-2基因的表達(dá)量在7～28d內(nèi)持續(xù)增高并達(dá)到峰值，之后逐漸下降，并且VRIL4/6-2-CPP組的表達(dá)量略高；IL-4基因的表達(dá)量在7～21 d內(nèi)持續(xù)增高并達(dá)到峰值，之后逐漸下降；21d之后可以觀察到VRIL4/6-2-CPP組的表達(dá)量逐漸高于VRIL4/6-CPP 和 VRIL2-CPP組（P＜0.05）。

2.3.2 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 整體來看（圖3），在免疫后21 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞含量均較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。

2.3.3 血清IgG、IgG1含量測(cè)定 如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的IgG、IgG1水平均較對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）。IgG含量在0～35d內(nèi)持續(xù)增加，IgG1含量保持平穩(wěn)，變化不大。

2.3.4 小鼠體重變化 整體來看，注射后0～35d，實(shí)驗(yàn)組小鼠的生長(zhǎng)速度明顯高于對(duì)照組小鼠（P＜0.05），見圖5。

圖2 免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的定量分析

圖3 小鼠CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的比例變化

圖4 實(shí)驗(yàn)小鼠血清IgG、IgG1含量變化

圖5 小鼠體重變化

3 討論

本研究中我們使用2A自剪切短肽連接豬IL-4/6和IL-2基因，獲得了一種新型有效的免疫調(diào)節(jié)分子。2A自剪切技術(shù)可使多個(gè)基因使用同一個(gè)啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)在同一載體中等量表達(dá)[6-7]，因此我們?cè)诒狙芯恐欣盟脖磉_(dá)了3個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞因子基因，從而增強(qiáng)豬對(duì)感染性疾病的免疫能力。體外淋巴母細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)了融合的VRIL4/6-2可在真核細(xì)胞中成功表達(dá)出IL-4/6和IL-2，且融合的IL-4/6和IL-2比單獨(dú)的IL-4/6或IL-2更能促進(jìn)細(xì)胞增殖。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，小鼠注射部位無局部炎癥發(fā)生，在35d的觀察期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組小鼠也檢測(cè)不到系統(tǒng)性的免疫反應(yīng)癥狀。

本研究還發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組血清的IgG含量明顯增加，且注射VRIL4/6-2的小鼠效果最佳，CD4和CD8分子、IL-2和IL-4基因的表達(dá)量也都在注射后不同時(shí)間段有所升高。表明注射VRIL4/6-2可加強(qiáng)小鼠的體液免疫、細(xì)胞免疫和免疫調(diào)節(jié)能力。同時(shí)，還觀察到注射VRIL4/6-2的小鼠比其他組生長(zhǎng)更快，與增強(qiáng)免疫的結(jié)果保持一致。這些結(jié)果有力地證實(shí)了CPP包裹的VRIL4/6-2納米顆?？捎行г鰪?qiáng)小鼠的生長(zhǎng)能力和免疫能力。

本研究證實(shí)了VRIL4/6-2能有效增強(qiáng)動(dòng)物的體液免疫和細(xì)胞免疫，可開發(fā)成安全有效的免疫增強(qiáng)劑。

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