(酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅 酒泉 735000)

1 材料

1.1 實驗菌株和細胞

RAW264.7 小鼠單核-巨噬細胞實驗室自留。

1.2 主要試劑及藥品

胰酶 美國 Hyclone公司

EDTA 美國 Sigma公司

二甲基亞砜(DMSO) 美國 Sigma公司

RPMI-1640 培養(yǎng)基 美國 Hyclone公司

脂多糖(LPS) 美國 Sigma公司

芹菜素標準品 中國藥品生物制品檢定所

1.3 主要儀器設(shè)備

細胞培養(yǎng)箱 SANYO 公司’細胞培養(yǎng)板 Costar公司

恒溫干燥箱 上海恒一公司

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 三洋公司

高壓蒸汽滅菌器 長春百奧生物公司

SW-CJ-IF 型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司

高速低溫臺式離心機 德國 EFFENDOF公司

顯微鏡 奧林巴斯公司

低溫高速冷凍離心機 德國 SORVALL公司

全自動酶標儀 奧地利 TECAN 公司

-80℃超低溫冰箱 SANYO 公司

顯微鏡 奧林巴斯 公司

手術(shù)器械 伯樂 公司

半干轉(zhuǎn)膜儀 美國伯樂 公司

濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀 BIO-RAD 公司

TH2-82 型恒溫振蕩器 上海躍進醫(yī)療器械廠

1.4 所需試劑的配制

(1) PBS緩沖液(ph 7.2)的配置

NaCl 8.0 g

Na2HPO4·12H2O 3.63 g

KCL 0.2 g

KH2P040.24 g

去離子水 800 mL

后調(diào)節(jié)pH值為7.2 定容至1.0 L

(2) SDS-PAGE 電泳10%分離膠

去離子水 1.9 mL

30%丙烯酰胺 1.7 mL

1.5M Tris-HCl(pH=8.8) 1.3 mL

10%SDS 50 μL

10%過硫酸銨 50 μL

TEMED 2 μL

(3) SDS-PAGE 電泳5%濃縮膠

去離子水 2.1 mL

30%丙烯酰胺 0.5 mL

1.0M Tris-HCl(pH=6.8) 380 μL

10%SDS 30 μL

10%過硫酸銨 30 μL

TEMED 3 μL

(4) pH=6.8 Tris-HCL(1M)的配置

Tris-Base 12.11 g

去離子水 80 mL

調(diào)節(jié)pH值至6.8去水定容至100 mL

(5)pH=88 Tris-HCL(1.5M)的配置

Tris-Base 18.17 g

去離子水 80 mL

調(diào)節(jié)pH值至8.8去離子水定容至100 mL

(6) 10%過硫酸胺

過硫酸銨 1 g

去離子水 10 mL

(7) Tris-甘氨酸電泳緩沖液

Tris 3.02 g

甘氨酸 18.8 g

SDS 1.0 g

去離子水定容至1.0 L

(8) Western blot 轉(zhuǎn)膜緩沖液的配置

Tris-Base 5.82 g

甘氨酸 2.93 g

SDS 0.375 g

甲醇 200 mL

加入去離子水定容至1 L

(9) TBS緩沖液(0.05%Tween-20)的配置

Tris-Base 2.422 g

NaCl 8.775 g

Tween 20

0.5 mL

去離子水定容至1.0 L

調(diào)節(jié)pH值至7.4

(10) 3% BSA

BSA 3 g

TBST 100 mL

200 mL

2 方法

2.1 藥物濃度篩選

2.1.1 配制細胞培養(yǎng)基 1640培養(yǎng)基中加入5%～10%的胎牛血清、1%谷氨酰胺和雙抗。

2.1.2 細胞的培養(yǎng) 從液氮中取出細胞，迅速在37°C水浴鍋中進行解凍，無菌操作將凍存管中的細胞倒入細胞培養(yǎng)瓶中，加入帶有胎牛血清的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。待細胞約長到80%時對細胞進行傳代培養(yǎng)。細胞消化需用胰酶進行消化，分裝入細胞培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)為后續(xù)的實驗進行準備。

2.2 MTT 法測定細胞毒性

對數(shù)生長期RAW264.7細胞4×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板，芹菜素濃度0～40 μM預(yù)處理細胞1 h，設(shè)置調(diào)零孔，空白對照孔，每組重復(fù)四個。培養(yǎng)24 h后，每孔滴價20 μL MTT，放置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄掉培養(yǎng)液，每孔滴加150 μL DMSO，并放置于振蕩器上震蕩，最后用酶標儀570 nm波長檢測。

2.3 qRT-PCR檢測細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6

2.3.1 實驗分組 空白對照組、LPS刺激組、芹菜素藥物組(10、20、40 μM)組，每組設(shè)有三個重復(fù)。

2.3.2 接種 RAW264.7細胞接種于6孔板中，芹菜素預(yù)處理1 h后，LPS (1 μg/mL)刺激細胞4 h，棄去培養(yǎng)上清，PBS洗滌2次，利用Trizol法提取RNA。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

2.3.3 反轉(zhuǎn)錄 取適量RNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如表1。

2.3.4 應(yīng)用primer premier 5.0軟件設(shè)計細胞因子的引物序列 如表1和表2所示。根據(jù)PCR試劑盒的說明書，按照表3所示的反應(yīng)體系檢測細胞因子TNFα、IL-1β和IL-6基因的表達情況。

表2 細胞因子的引物序列

表3 qRT-PCR反應(yīng)體系

2.4 免疫蛋白印跡

2.4.1 實驗分組 空白組、LPS組、芹菜素組(10、20、40μM)組，每組設(shè)五個重復(fù)。

2.4.2 接種 4×105個/mL 的RAW264.7 細胞接于 6 孔細胞板中，每孔約有2 mL，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度芹菜素藥物進行預(yù)處理1 h，LPS刺激細胞1 h，棄上清，用PBS進行清洗2到3次，加入蛋白裂解液200 μL進行裂解，用細胞刷收集細胞，5 min，12 000 p離心8 min，棄沉淀留上清，用BCA法測定蛋白濃度，最后加入相應(yīng)的Loading Buffer和PBS于100℃煮沸10 min，分裝并儲存于-80℃冰箱。

2.4.3 配膠 清洗玻璃板，并固定于電泳架上，按配方配制5 mL 10%分離膠，搖勻后迅速灌入兩塊玻璃板之間，輕輕加入1 mL蒸餾水壓平膠面，待膠凝固后，倒掉蒸餾水，配制5%的濃縮膠，迅速插入梳子，待其凝固。

2.4.4 上樣 將電泳緩沖液加入電泳槽內(nèi)，小心緩慢拔出梳子，然后將適量的蛋白樣品緩慢加入到梳孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡，安裝好電泳裝置，接通電源。

2.4.5 跑膠 濃縮膠，恒壓80 V，20 min；分離膠，恒壓120 V，80 min，條帶為一狹窄條帶。

2.4.6 轉(zhuǎn)膜 提前將剪好的濾紙放入轉(zhuǎn)膜緩沖液內(nèi)，剪下適應(yīng)大小的PVDF膜放入甲醇內(nèi)活化后，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中。膠、PVDF膜與濾紙大小一致，按如下順序：濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙依次放在轉(zhuǎn)膜儀上，注意每層不可留有氣泡，接通電源，進行轉(zhuǎn)膜。

2.4.7 封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束，將PVDF膜放入5%脫脂乳或3%BSA中進行封閉，室溫搖床封閉2～3 h。

2.4.8 一抗孵育 用TBST稀釋一抗，使用cell signaling抗體按1∶1 000比例稀釋，取出PVDF膜放入稀釋好的一抗溶液中，4℃孵育過夜。

2.4.9 洗膜 TBST溶液洗膜三次，每次5 min。

2.4.10 二抗孵育 按1∶50 000比例TBST稀釋二抗，取出PVDF膜放入稀釋好的二抗溶液中，室溫孵育2 h。

2.4.11 洗膜 TBST溶液洗膜三次，每次5 min。

2.4.12 顯影 配制ECL工作液：在避光的容器中按A液:B液=1∶1的比例配制，在PVDF膜上滴加適量的ECL工作液，顯影適當時間拍照，保存。

2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

將以上實驗結(jié)果進行方差分析，其結(jié)果用Means±SEM形式表示。數(shù)據(jù)差異性均采用方差分析和Student′s檢驗進行分析。P<0.05 和P<0.01 分別代表差異顯著和差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 芹菜素對 RAW264.7 細胞的活性影響

MTT 法檢測不同濃度的芹菜素對細胞活性的影響，如圖1所示，與空白對照組相比，芹菜素在0-40 μM范圍對細胞活性影響較小，表明以上三個藥物濃度對RAW264.7細胞沒有毒性反應(yīng)。

圖1 MTT法檢測芹菜素對RAW264.7細胞的毒性作用

3.2 芹菜素對LPS誘導(dǎo)的細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的影響

ELISA方法和qRT-PCR方法檢測芹菜素對LPS誘導(dǎo)炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1?水平的影響。結(jié)果顯示LPS刺激組的三種細胞因子與空白對照組相比顯著上升，而芹菜素在10～40 μM范圍內(nèi)能夠劑量依賴性地降低三種細胞因子的產(chǎn)生。

3.3 芹菜素對LPS刺激的RAW264.7細胞NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

LPS刺激細胞后，western blot結(jié)果顯示(圖3)，磷酸化的IκB、p65水平呈明顯上升趨勢。芹菜素在10～40 μM范圍內(nèi)能夠劑量依賴性地降低IκB 、p65的磷酸化水平。

圖2 實時熒光定量檢測細胞因子基因水平表達情況

圖3 Western Blot 檢測RAW264.7細胞NF-kB信號通路激活情況

3.4 芹菜素對LPS刺激的RAW264.7細胞MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

如圖所示，細胞被LPS刺激后，磷酸化ERK1/2、p38和JNK的水平呈現(xiàn)出顯著上升。相比之下，芹菜素在10～40 μM范圍內(nèi)能夠劑量依賴性地降低JNK、ERK1/2 和p38 的磷酸化水平。結(jié)果可以說明芹菜素對MAPKs 信號通路的激活起到了抑制的作用。

4 討論

炎癥是組織器官對損傷因子所產(chǎn)生的一種防御性反應(yīng)。主要表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等機能障礙。革蘭氏陰性菌的細胞壁的成分當中主要是LPS，LPS是引起炎癥反應(yīng)的炎癥的主要成分。主要表現(xiàn)為，刺激動物機體產(chǎn)生炎性細胞因子。炎性細胞因子對機體會產(chǎn)生嚴重的病理學(xué)反應(yīng)。前人已有研究，LPS刺激炎性細胞因子產(chǎn)生 TNF-α、IL-1β 和 IL-6等，細胞因子之間有相互協(xié)同作用。這些炎性細胞因子會引起強烈的炎癥反應(yīng)，會對機體產(chǎn)生極大的損害。炎癥反應(yīng)中最早出現(xiàn)的是TNF-α，可促使IL-1分泌， IL-1對機體的損傷和感染產(chǎn)生應(yīng)答并刺激其他炎性因子的產(chǎn)生，對炎癥發(fā)生過程起著重要的作用，IL-6在急性期炎癥發(fā)生過程中起到重要作用。

圖4 Western Blot 檢測RAW264.7細胞MAPK信號通路激活情況

研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以被TLR4信號通路識別，并激活下游的NF-κB 和 MAPKs信號通路來調(diào)控炎癥細胞因子基因水平的表達。p65與IκB以二聚體、無活性的形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)，在受到LPS刺激時，其二聚體發(fā)生解離，p65分子從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，啟動炎性細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，如TNF-α、IL-1β 和 IL-6。炎性細胞因子的產(chǎn)生與MAPKs信號通路也具有密切的關(guān)系，LPS刺激后，能夠?qū)е翸APKs信號通路中的ERK1/2，JNK 和 p38 的磷酸化水平上升。本實驗通過檢測芹菜素對 LPS 激活的 NF-κB 和 MAPKs表達來尋找其抗炎的機理。從實驗的數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)，芹菜素確實抑制了NF-κB 和 MAPKs 的激活。通過實驗結(jié)果我們可以的出下面的結(jié)論，芹菜素的抗炎作用很大程度上是因為抑制了NF-κB 和 MAPKs 的激活，所以抑制了炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)。

5 結(jié)論

芹菜素對RAM.264.7細胞沒有毒害作用。芹菜素在10～40 μM范圍內(nèi)能夠劑量依賴性地降低TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞因子的產(chǎn)生。芹菜素能明顯抑制RAM.264.7細胞中NF-κB和MAPKs信號通路的激活。

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