高小博，張辰#，鄭盼盼，駱海燕，馬旭，陸彩玲*

(1．國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100005)

砷是環(huán)境中普遍存在的一種類金屬元素，其在環(huán)境中以有機(jī)砷化合物和無機(jī)砷化合物的形式存在，無機(jī)砷化合物主要以三價砷和五價砷化合物為主[1]。亞砷酸鈉暴露嚴(yán)重影響胚胎神經(jīng)、心血管等多個系統(tǒng)的正常發(fā)育，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩甚至出現(xiàn)畸形[2-3]。有研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是亞砷酸鈉誘導(dǎo)的胚胎以及細(xì)胞毒性的可能機(jī)制之一，亞砷酸鈉通過降低過氧化氫酶的活性，增加超氧化物歧化酶活性，打破細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而使得細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平升高[4]。

p66Shc是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，對線粒體ROS代謝起重要的調(diào)控作用[5]。我們實驗室前期報道顯示小鼠胚胎經(jīng)亞砷酸鈉處理后，卵裂受到明顯的抑制，滯留在2-細(xì)胞期的胚胎比例升高，而發(fā)育至囊胚期的胚胎數(shù)量明顯降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉通過擾亂p66Shc相關(guān)的氧化還原平衡狀態(tài)，使谷胱甘肽(GSH)水平降低，ROS水平升高，引起胚胎毒性[6]。原核注射p66Shc siRNA降低胚胎ROS水平，促進(jìn)胚胎從2-細(xì)胞期向桑葚期的發(fā)育過程，從而緩解亞砷酸鈉引起的小鼠胚胎育異常[7]。亞砷酸鈉暴露導(dǎo)致斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育遲緩、心臟環(huán)化異常、心包水腫、軀干彎曲以及尾部發(fā)育異常，而抗氧化劑葉酸能夠緩解亞砷酸鈉引起的發(fā)育異常，進(jìn)一步的體外實驗結(jié)果表明葉酸通過抑制p66Shc的表達(dá)，降低細(xì)胞ROS水平，從而拮抗亞砷酸鈉引起的生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)[8-9]。朱海英等[10]在研究中發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉刺激引起心肌細(xì)胞ROS水平升高，p66Shc表達(dá)上調(diào)，第36位絲氨酸磷酸化水平升高。以上研究表明p66Shc在亞砷酸鈉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。然而，亞砷酸鈉引起胚胎p66Shc表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制尚不明確。

Sirtuin 1(Sirt1)是一種高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的Ⅲ型組蛋白去乙?；?。Sirt1在體內(nèi)能夠參與衰老、免疫、發(fā)育、代謝等多種重要的生理活動。一些研究表明Sirt1對小鼠胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞的正常分化、胚胎干細(xì)胞干性的維持以及心臟發(fā)育過程中心肌細(xì)胞的雙核化有重要的調(diào)控作用[11-13]。Kumar等[14]研究發(fā)現(xiàn)Sirt1通過調(diào)控p66Shc的賴氨酸乙?；閷?dǎo)了糖尿病誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙。Zhou等[15]報道顯示在高糖暴露的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Sirt1通過與p66Shc啟動子區(qū)域相結(jié)合，引起與p66Shc啟動子區(qū)域結(jié)合的組蛋白H3的乙?；潭冉档停瑥亩?fù)調(diào)控p66Shc的表達(dá)。由此可見Sirt1在氧化應(yīng)激引起的組織細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮重要的作用，但是在亞砷酸鈉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激機(jī)制中，Sirt1發(fā)揮的作用以及與p66Shc之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系未見報道，因此本研究以Sirt1為切入點，探究了亞砷酸鈉對胚胎p66Shc表達(dá)調(diào)控的分子作用機(jī)制。

材料和方法

一、實驗材料

HEK293ET細(xì)胞屬于人胚胎腎上皮細(xì)胞系，購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。培養(yǎng)在37℃、5%CO2的飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至90%左右時，用濃度為0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1/3傳代繼續(xù)培養(yǎng)；2/3接種于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時進(jìn)行實驗。

二、研究方法

1. 藥物及試劑的配制：亞砷酸鈉用滅菌水將其配成1 mol/L的貯存液，貯存于-80℃冰箱，分裝備用。實驗時利用培養(yǎng)基將其稀釋成5 μmol/L的使用濃度。根據(jù)Silencer select Pre-designed siRNA說明書操作步驟，向包含siRNA粉末的管中加入50 μl無RNA酶水，配制成終濃度為50 μmol/L siRNA儲備液，分裝后-80℃保存，轉(zhuǎn)染時利用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至100 nmol/L的工作濃度。

2. siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞：Sirt1-siRNA和對照siRNA均購自于美國Invitrogen公司，Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染設(shè)為實驗組，對照siRNA轉(zhuǎn)染為對照組。其中Sirt1-siRNA序列為：sense：5′-CCCUGUAAAGCUUUCAGAA(dTdT)-3′；antisense：5′-UUCUGAAAGCUUUACAGGG(dTdT)-3′。HEK293ET細(xì)胞被種植于12孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長至50%～60%融合時根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑lip2000(Thermo，美國)說明書建議的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。siRNA工作濃度為100 nmol/L，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞樣品提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Western Blot檢測。

3. 亞砷酸鈉處理細(xì)胞：HEK293ET細(xì)胞生長到70%～80%融合時加入5 μmol/L亞砷酸鈉培養(yǎng)基處理24 h，對照組未經(jīng)亞砷酸鈉處理，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測。對于siRNA轉(zhuǎn)染的HEK293ET細(xì)胞，待siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，更換培養(yǎng)基，加入5 μmol/L亞砷酸鈉培養(yǎng)基處理24 h，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測。

4. Western Blot檢測：HEK293ET細(xì)胞樣品收集后加入細(xì)胞裂解液50 μl，冰上裂解0.5 h，12 000 rpm離心15 min，收集上清。二喹啉甲酸法定量蛋白濃度，12%聚丙烯酰氨凝膠分離蛋白，300 mA濕轉(zhuǎn)2 h至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，加入適量稀釋比例的一抗p66Shc(兔多克隆抗體，Santa Cruz，美國，1∶800)、Sirt1(兔多克隆抗體，Santa Cruz，美國，1∶1 000)、β-actin(小鼠單克隆抗體，Sigma，美國，1∶2 000)，4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，1∶2 000稀釋二抗[辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物)]，室溫孵育1 h，1×TBST 洗膜3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，用Image J軟件定量分析蛋白條帶灰度值。

5.細(xì)胞RNA的提取以及實時定量PCR(Q-PCR)分析檢測：HEK293ET細(xì)胞經(jīng)亞砷酸鈉處理后收集細(xì)胞樣品，加入RNA提取試劑TRIzol(Invitrogen，美國)提取RNA。取1 μg RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA作為模板，采用Q-PCR儀器(ABI Prism 7500，美國)檢測細(xì)胞p66Shc和β-actin mRNA的水平，其中β-actin為內(nèi)參對照。p66Shc和β-actin的Q-PCR引物序列如表1所示，Q-PCR引物均由華大基因公司(中國)合成。

表1 PCR引物序列

三、統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、亞砷酸鈉處理引起p66Shc轉(zhuǎn)錄水平升高

我們課題組前期研究表明亞砷酸鈉處理引起胚胎p66Shc表達(dá)水平的升高，為了進(jìn)一步探究分子機(jī)制，我們利用HEK293ET細(xì)胞，檢測亞砷酸鈉對p66Shc轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，5 μmol/L亞砷酸鈉處理組p66Shc轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。

與未經(jīng)亞砷酸鈉處理組比較，***P<0.001圖1 亞砷酸鈉處理引起p66Shc轉(zhuǎn)錄水平升高

二、亞砷酸鈉抑制Sirt1的表達(dá)

為了探究亞砷酸鈉暴露條件下Sirt1和p66Shc的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，我們檢測了亞砷酸鈉對Sirt1表達(dá)情況的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，5 μmol/L亞砷酸鈉處理組Sirt1的蛋白水平顯著降低(圖2 A)，灰度分析結(jié)果顯示5 μmol/L亞砷酸鈉處理組Sirt1的蛋白表達(dá)水平較對照組降低約60%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2 B)。

A：Western Blot檢測亞砷酸鈉處理后Sirt1的表達(dá)情況；B：Sirt1的灰度分析柱狀圖；與未經(jīng)亞砷酸鈉處理組比較，***P<0.001圖2 亞砷酸鈉抑制Sirt1的表達(dá)

三、siRNA抑制Sirt1的表達(dá)

為了檢測亞砷酸鈉處理后Sirt1對p66Shc表達(dá)情況的影響，需要對Sirt1進(jìn)行敲低，100 nmol/L對照siRNA和Sirt1 siRNA分別轉(zhuǎn)染HEK293ET細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，對照siRNA轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，Sirt1的表達(dá)未出現(xiàn)明顯的變化，Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組與對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比Sirt1的表達(dá)顯著降低(圖3A)，灰度分析結(jié)果顯示Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組Sirt1的表達(dá)水平較對照siRNA轉(zhuǎn)染組降低約80%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖3 B)。

A：Western Blot檢測未轉(zhuǎn)染組、對照 siRNA轉(zhuǎn)染組和Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Sirt1的表達(dá)情況;B：未轉(zhuǎn)染組、對照 siRNA轉(zhuǎn)染組和Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組Sirt1的灰度分析柱狀圖;Con：未轉(zhuǎn)染對照組；si-NC：對照siRNA轉(zhuǎn)染組；si-Sirt1：Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組;與si-NC組比較，***P<0.001圖3 siRNA抑制Sirt1的表達(dá)

四、亞砷酸鈉通過Sirt1調(diào)控p66Shc的表達(dá)

為了檢測亞砷酸鈉處理后Sirt1對p66Shc表達(dá)的影響，100 nmol/L對照siRNA和Sirt1 siRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后更換培養(yǎng)基，加入含有5 μmol/L亞砷酸鈉的培養(yǎng)基處理24 h，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在5 μmol/L亞砷酸鈉暴露的條件下，Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組Sirt1的表達(dá)較對照siRNA轉(zhuǎn)染組明顯降低，而p66Shc的表達(dá)明顯升高(圖4A)，灰度分析結(jié)果顯示亞砷酸鈉暴露的條件下，與對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組Sirt1的表達(dá)水平降低幅度超過90%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4 B)，而Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組p66Shc的表達(dá)水平是對照siRNA轉(zhuǎn)染組的約1.9倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖4 C)。

A：Western Blot檢測在亞砷酸鈉暴露的條件下，對照 siRNA和Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Sirt1和p66Shc的表達(dá)情況；B：對照 siRNA和Sirt1 siRNA組Sirt1的灰度分析柱狀圖；C：對照 siRNA和Sirt1 siRNA組p66Shc的灰度分析柱狀圖；si-NC：對照siRNA轉(zhuǎn)染組；si-Sirt1：Sirt1 siRNA轉(zhuǎn)染組；與si-NC組比較，***P<0.001圖4 亞砷酸鈉通過Sirt1調(diào)控p66Shc的表達(dá)

討 論

諸多的報道已經(jīng)證實亞砷酸鈉具有胚胎毒性，如 Senuma等[16]報道顯示亞砷酸鈉影響胎鼠腦部5-羥色胺能神經(jīng)元的早期發(fā)育。McCollum等[17]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎經(jīng)亞砷酸鈉處理后表現(xiàn)出嚴(yán)重的血管發(fā)育異常。一些研究認(rèn)為亞砷酸鈉通過擾亂氧化還原平衡，引起細(xì)胞組織氧化損傷，如Li等[18]報道顯示亞砷酸鈉處理人肝臟HHL-5細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平、凋亡率呈劑量依賴式升高，細(xì)胞色素c和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高。Gong等[19]報道亞砷酸鈉暴露顯著增加人上皮細(xì)胞ROS水平，降低細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)水平，降低細(xì)胞色素c氧化酶活性和線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而激活一系列炎癥相關(guān)信號通路，引發(fā)細(xì)胞損傷。Sirt1作為一種參與細(xì)胞內(nèi)多種重要生理活動的組蛋白去乙?；福陙砗芏嘌芯勘砻鱏irt1與氧化損傷存在密切的聯(lián)系。如，Gay等[20]報道顯示Sirt1在過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷模型中表達(dá)發(fā)生下調(diào)。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)咖啡酸苯乙酯能夠通過激活Sirt1/內(nèi)皮細(xì)胞性一氧化氮合酶(eNOS)通路，恢復(fù)Sirt1的表達(dá)，從而緩解缺氧/復(fù)氧引起的大鼠心肌細(xì)胞的氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉處理引起Sirt1的表達(dá)顯著降低，提示Sirt1對亞砷酸鈉誘導(dǎo)的氧化損傷可能具有重要的作用。

報道顯示p66Shc能夠通過氧化細(xì)胞色素c介導(dǎo)線粒體ROS的產(chǎn)生[22]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉處理引起小鼠胚胎p66Shc表達(dá)上調(diào)和ROS水平升高，原核注射p66Shc siRNA能抑制砷引起的ROS升高和胚胎毒性[6-7]。另外，我們體外研究表明亞砷酸鈉通過上調(diào)細(xì)胞p66Shc的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞ROS水平升高，抑制細(xì)胞活力[8]。Zhou等[15]報道Sirt1在轉(zhuǎn)錄水平上抑制p66Shc的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉處理細(xì)胞后，p66Shc轉(zhuǎn)錄水平升高，而Sirt1的蛋白水平降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在亞砷酸鈉暴露的細(xì)胞內(nèi)，利用siRNA抑制Sirt1的表達(dá)顯著上調(diào)p66Shc的表達(dá)。由此可見Sirt1對p66Shc的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用，提示亞砷酸鈉可能通過抑制Sirt1的表達(dá)而上調(diào)胚胎p66Shc的表達(dá)，但仍需進(jìn)一步驗證。

Trinei等[23]報道顯示p53通過上調(diào)p66Shc的表達(dá)介導(dǎo)過氧化氫引起的細(xì)胞氧化損傷。高糖誘導(dǎo)下細(xì)胞p53和Sirt1均可以通過影響p66Shc的表達(dá)而調(diào)控細(xì)胞ROS水平[24]。此外，有報道顯示Sirt1的轉(zhuǎn)錄能夠被p53調(diào)控，被激活的p53能夠與Sirt1啟動子區(qū)域上兩個p53相應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)控Sirt1的表達(dá)[25-26]。因此，亞砷酸鈉引起的p66Shc表達(dá)變化的分子機(jī)制以及Sirt1和p66Shc在亞砷酸鈉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激機(jī)制中發(fā)揮的作用還有待進(jìn)一步探究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉處理后p66Shc轉(zhuǎn)錄水平升高，Sirt1表達(dá)發(fā)生下調(diào)，而敲低Sirt1后p66Shc的表達(dá)明顯升高，提示亞砷酸鈉通過抑制Sirt1促進(jìn)p66Shc的表達(dá)，提出了亞砷酸鈉對胚胎p66Shc表達(dá)調(diào)控的一種可能機(jī)制。

【參 考 文 獻(xiàn)】

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